DNA甲基化参与非小细胞肺癌细胞（A549/DDP）顺铂耐药的研究

DNA甲基化通过调控药物代谢通路中关键基因的表达，参与肿瘤细胞对化疗药物的耐受机制。我们前期通过体外实验证实去甲基化药物5-aza-dC联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA显著逆转NSCLC顺铂耐药株A549/DDP耐药表型，并可能与错配修复基因hMLH1去甲基化有关。本项目拟进一步研究二者联合对A549/DDP细胞体内种植瘤化疗敏感性的影响，并通过甲基化芯片筛选A549/DDP与亲本细胞A549的差异性甲基化位点，结合生物信息学分析可能参与顺铂耐药的关键基因，在各组药物处理的A549/DDP细胞株和种植瘤中进一步验证。继而通过新鲜NSCLC组织体外药敏试验，以及回顾性分析含顺铂方案化疗的初治NSCLC患者资料(ORR、PFS、OS)，明确上述关键基因的甲基化与顺铂化疗敏感性的关系。可望阐明表观遗传修饰剂在逆转NSCLC细胞顺铂耐药表型中的作用及其机制，并筛选一组顺铂化疗敏感性预测的甲基化谱。

本课题研究目的在于明确DNA甲基化参与非小细胞肺癌（NSCLC）顺铂耐药机制，进而探索逆转耐药策略。首先通过药物持续暴露建立NSCLC顺铂耐药株（A549/DDP），通过 Agilent Human 8*60 表达谱芯片和 Illumina HumanMetylation450K甲基化芯片，筛选顺铂耐药 A549/DDP与亲本株 A549细胞的差异。在 A549/DDP中表达下调、高甲基化的共372个基因，这些基因的功能涉及细胞粘附、细胞分化、细胞增殖的负性调节信号、药物反应、GTPase 介导的信号转导、胚胎发育、缺氧反应、细胞骨架组织等大部分人体生物学过程；10个基因（S100P, GDA, WISP2, LOXL1, TIMP4, ICAM1, CLMP, HSP8, GAS1, BMP2）被挑选出来在原代肿瘤细胞与 TCGA (the Cancer Genome Atlas)标本中验证与顺铂敏感性的关系；体内外实验证实低剂量的 5-Aza-dC（1μM） 和TSA （100nM ）联合， 可逆转顺铂耐药性，伴随候选基因（GAS1,TIMP4, ICAM1和WISP2）的去甲基化，表达恢复；A549/DDP过表达 GAS1直接抑制细胞增殖，诱导细胞周期组织，增强凋亡，并增加细胞对顺铂的敏感性。此外，本研究还发现，绿茶的主要有效成分茶多酚没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）可逆转NSCLC细胞的顺铂耐药性，其机制也与候选基因（GAS1,TIMP4, ICAM1和WISP2）的去甲基化、表达恢复有关系。总之，我们发现候选基因高甲基化在NSCLC顺铂耐药形成中具有重要作用，表观遗传修饰剂可能通过去甲基化作用逆转顺铂耐药性。上述研究结果已发表于Epigenetics（IF=5.108）和Biomedicine & pharmacotherapy（已接受，待刊，IF=2.108）