HOXA11与其天然反义转录本HOXA11-AS在非小细胞肺癌顺铂耐药形成中的相互作用及表观遗传调控

With the support of the early National Natural Science Foundation (No.81101650), we have screened a pair of natural antisense transcripts (NATs) by high-throughput microarrays, a member of homeobox genes (homeobox gene) HOXA11 and a non-coding RNA HOXA11-AS. They range in a head-to-head manner, with complementary overlap in 5'UTR. They are subject to the same regulation by methylation, with consistent gene expression. Preliminary results indicated that hypermethylation-induced silence or downregulation of HOXA11 and HOXA11-AS were associated with cisplatin resistance in non-small cell lung cancer(NSCLC). This project will further study how HOXA11 and HOXA11-AS interact with each other, whether they have synergistic role in the forming of NSCLC resistant phenotype? As a regulatory RNA, NAT is one of the important epigenetic regulation mechanisms, there are close relationships within NAT, DNA methylation and histone modifications. The project will also study the epigenetic regulation of HOXA11 and HOXA11-AS. Which signaling pathway plays a major role in the regulation of cisplatin resistance of HOXA11 gene? Are there any other target molecule proteins participated? What regulatory networks they constitute

在前期自然科学基金资助下，我们筛选出一对天然反义转录本(NATs)，同源框基因（homeobox gene）家族成员HOXA11与另一个非编码RNA HOXA11-AS，二者以头对头（5'-5'）形式互补重叠，受到相同模式的DNA甲基化调控，基因表达变化也一致。初步结果显示，高甲基化诱导的HOXA11与HOXA11-AS表达沉默与非小细胞肺癌（NSCLC）顺铂耐药形成有关。本项目将从细胞和动物水平，进一步深入研究HOXA11/HOXA11-AS之间存在怎样的相互作用，是否协同促进NSCLC耐药表型形成。作为一种调节性RNA，NATs是表观遗传修饰调控的重要内容之一，与DNA甲基化、组蛋白修饰之间存在密切关系。本项目还将探讨HOXA11与HOXA11-AS的表观遗传学调控机制，HOXA11通过何种信号通路调控NSCLC顺铂耐药，还有哪些参与的靶分子蛋白，构成怎样的调控网络。

位于染色体 7p15 的同源框基因(homeobox gene)家族成员 HOXA11(NM_005523)及其天然反义转录本 HOXA11-AS(HOXA11 antisense RNA, NR_002795)以头对头（5′- 5′）方式互补重叠，共享启动子区的两个 CpG 岛。 我们原本认为，二者受到相同模式的 DNA 甲基化调控，基因表达变化和功能作用应该一致。然而，HOXA11-AS 在顺铂耐药的A549/DDP细胞株和原代培养细胞中均表达上调，而HOXA11则表达下调，并伴有 CpG 1 和 CpG 2的高甲基化。5-aza-CdR 处理A549/DDP细胞株，发现HOXA11表达恢复，CpG 1 和 CpG 2的高甲基化状态得到逆转，而HOXA11-AS表达不受影响。说明HOXA11的表达调控主要由CpG岛甲基化影响，而HOXA11-AS的表达调控则与其他机制有关。进一步的基因敲除和过表达实验证实 HOXA11 与 HOXA11-AS 彼此为负性调控关系，luciferase实验表明互相重合的5′UTR是二者之间相互作用的基础。体内外功能实验进一步证实，肺腺癌DDP耐药形成中，HOXA11发挥抑癌基因作用，HOXA11-AS则具有癌基因功能。.根据转录本测序结果，在A549/DDP耐药细胞较亲本株上调的mRNA 中谷胱甘肽过氧化物酶2（antioxidantenzyme glutathione peroxidase 2，GPX2）位于首位。GPX2是对脂氢过氧化物进行催化还原和消除ROS的主要酶，推测GPX2升高与凋亡抵抗有关。生物信息分析与GPX2 结合的miRNA，包括在A549/DDP细胞中下调的mir-10a、mir-182、mir-183。进一步的Luciferase、位点突变和功能实验证实GPX2是mir-10a的作用靶点。.此外，项目组还在cas9文库筛选A549/DDP细胞中的增敏相关基因，环状NRA (hsa_circRNA_103809) 促进肺腺癌增殖的机制，miR-150调控NOTCH3 表达参与肺腺癌 EGFR-TKI 耐药机制等方面进行拓展研究。该系列研究对深入了解肺腺癌发生发展和化疗耐药机制具有重要意义。