补肾填精方激活AC/cAMP/PKA通路促进骨细胞初级纤毛力学效应治疗骨质疏松性骨折的机制研究

Dynamic mechanical loading plays a key role in both bone remodeling and fracture healing process, which alters bone strain and capillary hydraulic gradient to contribute the fluid flow in the microstructure in bone tissues. The primary cilia is a mechanosensor in the osteocyte. The shear force from fluid flow make cilia oscillate, initiating and directing intracellular signalling cascades in response to external stimuli. For osteocyte, it may stimulate MSCs transform to osteoblast, which may contribute bone formation. Due to this important role, we hypothesised that increasing primary cilia mechanosensitivity would enhance the downstream response. To test this hypothesis, the hindlimb suspension model will be used to combine with unilateral tibial osteotomy to establish an functional-disused osteoporotic fracture model. Previous work showed Bushen Tianjing Formula (BSTJF) had a potential effect on bone formation via various signaling pathway of osteoblast differentiation in aging and hormonal osteoporosis model. This work will demonstrate the role of osteocytic primary cilia under the BSTJF in both bone remodeling and fracture healing via AC/cAMP/PKA signaling pathway in functional-disused osteoporotic fracture model.

动态机械载荷在骨重建和骨折愈合等过程中具有促进作用，通过改变骨应变和毛细血管液压梯度，影响骨组织内的骨陷窝-小管网络结构内流体，使广泛存在于骨基质中的骨细胞初级纤毛在流体剪切力作用下发生摆动，通过AC/cAMP/PKA通路将机械信号转化为生物化学信号，促进成骨细胞分化和矿化。前期研究发现补肾填精方对激素性和增龄性骨质疏松模型以及胫骨骨折大鼠均能通过促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用，增加骨形成，加快骨折愈合，并增大骨强度。为验证该方药理作用与机械信号的关联，以及骨细胞对骨髓间充质干细胞分化的调控功能，本项目采用下肢功能性失用骨质疏松模型，复合单侧胫骨截骨术，从机械-生物-化学角度，深入研究补肾填精方在功能性失用和骨折愈合两个病理过程，激活AC/cAMP/PKA通路，增强骨细胞初级纤毛力学感知，整合生物化学信号应答，调控骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞，促进骨折愈合，抑制骨量丢失的机制。

本项目对大鼠采用尾吊下肢悬空，2周后可造成下肢失用性骨量丢失，然后对左侧胫骨行截骨术，术后仍然保持尾吊状态，以此可以模拟骨质疏松性骨折后低载荷的骨折愈合过程。制备大鼠失用性骨质疏松性骨折模型。.通过持续每周的X线观察，结果发现，失重状态会显著阻碍骨折愈合的速度，补肾填精方可在失重状态下，加快骨折愈合的速度。对骨痂定量发现，失重状态下，骨痂体积显著增大，但骨痂孔隙率也显著增大。正常骨折组中，经过补肾填精方的干预，骨折愈合显著加快，骨痂相对对照组，显著致密。而在失重组中，经过补肾填精方的干预，骨折愈合速度较原来加快，但较正常对照组慢，骨痂形态和密度显著致密。通过力学测试发现，补肾填精方有助于提升骨折愈合后骨骼的刚性，表明更为致密的骨痂所提供的强度更大。HE染色显示，对照组的骨折线模糊，骨细胞生长密集，表明愈合状态良好；补肾填精方干预组已完成软骨内成骨，表明该中药复方可显著在骨重建阶段促进骨折愈合；HLS组对照组中，骨折愈合缓慢，缺少应力刺激，骨折愈合停留在软骨痂阶段，骨细胞分布稀疏；通过补肾填精方干预后，.体外实验部分，本研究采用MLO-Y4细胞株来研究骨细胞初级纤毛与成骨效应的关联。通过纤毛发生相关的IFT88蛋白抑制剂干预，成功缩短了MLO-Y4细胞初级纤毛的长度。通过流体干预下细胞表面剪切力的改变，进一步观察纤毛形态的改变。结果发现，流体不会显著促进纤毛长度，但会增加其下游通路相关蛋白（AC6、cAMP表达）。文献报道氯化锂作为IFT88的激活剂，通过干预，可显著逆转因IFT88抑制而引起的纤毛缩短，在静态和动态加载中，均呈现出显著的变化。本研究选择了淫羊藿苷和齐墩果酸这两个药物单体作为体外干预，结果显示，淫羊藿苷可以显著促进MLO-Y4细胞初级纤毛的长度，通过流体动态加载，AC6和cAMP表达显著增加；而齐墩果酸则未见显著改变。表明补肾填精方中的淫羊藿苷主要针对纤毛的生长，从而促进骨细胞力学敏感性，加速成骨效应的。