利用小分子单克隆抗体技术解析维药新塔花治疗动脉粥样硬化的物质基础研究

Previous studies have shown that, the disease of Tianxiangdan treating coronary atherosclerotic using traditional Chinese medicine, has the effect of composition. The main components in the compound for the new research confirms that Ziziphora bungeana Juz, arteriosclerosis, improve blood lipid effect is exact, but pharmacodynamic material basis is not clear, now recognized as the main representative of Ziziphora bungeana Juz component is the Ziziphora bungeana Juz flavonoids. This topic using small molecule monoclonal antibody technology, through artificial antigen synthesis of flavonoids obtained Ziziphora bungeana Juz, Ziziphora bungeana Juz flavonoids positive monoclonal cell lines, the preparation of its monoclonal antibody; monoclonal antibody as a tool to establish the specificity, knock method in addition to the Ziziphora bungeana Juz flavone, preparation of specific immunity in addition to the Ziziphora bungeana Juz flavonoids on affinity chromatography column, to obtain specific knockout Ziziphora bungeana Juz flavonoids new tower water extract, by comparison, by means of a cell model corresponding to the medicine of traditional indications and modern pharmacological function, to evaluate the effect of static and dynamic, and biological indicators combined with the standard, the Ziziphora bungeana Juz and Ziziphora bungeana Juz of flavonoids between Atherosclerotic Vulnerable Plaque efficacy of relevance and contribution, experimental basis will also lay the dose-response relationship of using specific knock division research of index components and its effect.

前期研究证实，采用中药、维药组成的复方天香丹治疗冠心病等动脉粥样硬化性疾病具有疗效。该复方主要成分为新塔花，研究证实抗动脉硬化、改善血脂作用确切，但是药效物质基础尚不清楚，目前公认为新塔花主要代表性成分是新塔花黄酮。本课题利用小分子单克隆抗体技术，通过合成新塔花黄酮的人工抗原，获取新塔花黄酮阳性单克隆细胞株，制备其单抗；以此单抗为工具，建立特异性敲除新塔花黄酮的技术方法，制备特异性敲除新塔花黄酮的免疫亲合色谱柱，获得特异性敲除新塔花黄酮的新塔花水提物，通过差异性比较的方法，借助与该药传统主治功效和现代药理作用相对应的细胞模型，以静态与动态、药效与生物学指标相结合的评价标准，阐明新塔花和新塔花黄酮对动脉粥样硬化易损斑块功效之间的关联性与贡献度，也将奠定利用特异性敲除法研究维药指标成分与其功效的量效关系研究的实验基础。

本项目在前期天香丹治疗冠心病等动脉粥样硬化性疾病疗效确切的基础上，研究该复方主要成分新塔花抗动脉粥样硬化的物质基础。目前公认为新塔花主要代表性成分是新塔花黄酮。故首先对新塔花总黄酮进行提取、纯化、鉴定。选择芦丁、地奥司明、金丝桃苷、蒙花苷进行了人工抗原的合成与鉴定、取偶联效果较好的金丝桃苷合成抗原免疫动物，用间接ELISA方法测定血清抗体效价和竞争性以检测所合成抗原的免疫原性。制备了单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株并研究抗体的特异性、制备免疫亲和色谱柱和特异性敲除新塔花黄酮样品。采用HPLC法测定特异性敲除新塔花黄酮样品敲除前后的含量。并研究新塔花总黄酮对内皮细胞损伤的作用。. 新塔花总黄酮的含量73%。共鉴定出十个成分，分别是黄芩素、槲皮素、白杨素、地奥司明、蒙花苷、芦丁、金丝桃苷、槲皮素3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素、山萘酚。合成芦丁、地奥司明、金丝桃苷及蒙花苷的人工抗原和人工包被抗原，鉴定成功。间接ELISA法检测抗血清效价达1：32000。阳性杂交瘤细胞株筛选AA9孔细胞融合率为100%，阳性率为4.12%。腹水诱导法大量制备单克隆抗体，腹水效价达1：64000以上。辛酸硫酸铵法纯化腹水的纯度为92%；蛋白G柱法纯化前的单抗腹水蛋白浓度为4.28mg/mL，纯化后的浓度为2.16mg/mL；以ELISA法测定纯化前后抗体效价和竞争、交叉反应，效价达1：64000以上，且未出现交叉反应。纯化后的金丝桃苷单抗与凝胶的偶联率为99.3%，偶联比为3.4mg/mL；外标法计算敲除前后样品中金丝桃苷含量结果为原上样新塔花溶液中约90%的金丝桃苷已经被敲除，通过对洗脱液中金丝桃苷含量的测算亲和柱回收率达97.2%。新塔花总黄酮作用于H2O2诱导的内皮细胞，可提高SOD,抑制MDA.降低LDH，起到保护内皮细胞损伤的作用。. 本研究制备了金丝桃苷单克隆抗体，筛选出金丝桃苷阳性杂交瘤细胞株，特异性敲除金丝桃苷的新塔花提取液，研究其对内皮细胞损伤具有保护作用。为研究新塔花抗动脉粥样硬化的作用奠定了一定的基础。