CXC趋化因子家族错义突变I123T和A181V与创伤并发症易感性的临床关联和功能研究

Sepsis and Multiple Organ Dysfunction Sydrome are the main severe complications after major trauma, they pose a great threat to human health. CXC chemokine famliy genes play an important role in the immflamation and immune related diseases. Our previous studies have found that missense mutations CXCL16 I123 and A181V have close relationship with the morbidity of sepsis and multiple organ failure, they are in highly Linkage disequilibrium, suggesting that they maybe two functional single nucleotide polymorphism. In order to further clarify the functional significance of them, we attempted to reveal the influence of I123 and A181V on leukocyte chemotaxis, adhere and endotoxin removal, by a serial of technic such as vector construction, recombinant protein purification and protein structure modeling. Furthermore, we reconfirm our results using samples from trauma patients with different genotypes. This study was designed to demonstrate the functional significance of CXCL16 I123 and A181V and clarify the mechanism of their impact on the outcome of the severe trauma patients. It will provide new molecular markers for the early warning of complications of severe trauma patients.

脓毒症和多器官功能障碍综合征是创伤后最常见的严重并发症，对人类健康造成巨大威胁。CXC趋化因子家族与炎症和免疫反应密切相关，前期研究发现，CXCL16 I123T和A181V在严重创伤人群中与脓毒症和多器官功能衰竭发病率密切相关，这两个位点高度连锁不平衡，且都是有氨基酸改变的错义突变，提示可能是两个功能性位点。为深入研究其功能意义，本课题拟对从其影响CXCL16趋化因子的白细胞趋化、粘附和内毒素清除这三方面功能，利用载体构建、真核表达、重组蛋白纯化及蛋白质构型模建等系列实验，证明I123T和A181V的功能意义。并进一步利用不同基因型的严重创伤患者样本进行在体验证。研究拟从功能上明确CXCL16 I123T和A181V影响严重创伤患者预后的机制，为严重创伤并发症的预警诊断提供新的分子标志。

脓毒症和多器官功能障碍是创伤后最常见的严重并发症，对人类健康造成巨大威胁。创伤并发症的主要病理基础是炎症反应，CXC趋化因子家族参与了免疫细胞趋化和免疫调节等免疫炎症反应，是研究创伤脓毒症预警诊断重要候选基因。我们通过焦磷酸测序的方法，首先观察了重庆地区（1051例）、浙江（353例）、云南（309例）和贵州（294例）严重创伤患者中CXCL16基因多态性位点rs1050998（I123T）和rs2277680（A181V）的发生频率并进行了关联分析。统计结果分析显示位于CXCL16外显子区的错义突变SNP位点I123T和A181V最小等位基因频率分别为39.9%和38.3%。该位点与创伤后脓毒症的发生和多器官功能衰竭评分显著相关。rs1050998位点A等位基因携带者MODS评分也显著高于G等位基因携带者（P=0.046）。rs2277680位点T等位基因携带者创伤后患脓毒症的几率显著大于C等位基因携带者（P=0.013）。同时，T等位基因携带者MODS评分也显著高于C等位基因携带者（P=0.026）。说明这两个位于外显子区的错义突变位点可能是与创伤后并发症易感性密切相关的多态性位点。为深入研究其功能意义，我们从I123T和A181V影响CXCL16趋化因子的白细胞趋化、粘附和内毒素清除这三方面功能，我们构建了I123A181、 T123A181、 I123V181 和 T123V181的四种质粒，分别转染白细胞后，携带181V的两种质粒转染白细胞后，白细胞的趋化能力均显著增强。LPS清除实验显示，携带181V的两种质粒转染白细胞后，白细胞清除LPS的能力显著增强。蛋白质结构模建实验结果显示，A181V突变位于基因保守区，A181V突变后，CXCL16蛋白活性中心口袋结构可能发生了改变，V氨基酸的疏水性使得其往里面埋藏，从而有可能使得活性中心缩小进而影响CXCL16蛋白质的结构，这可能是该位点影响LPS转运和白细胞趋化的结构基础。我们研究结果，发现了CXCL16的基因多态性位点A181V与创伤严重并发症后脓毒症发生率密切相关，其分子机制可能是其结构变化引起了CXCL16蛋白活性中心结构改变，从而影响了脓毒症发生时LPS转运和白细胞趋化，我们的研究为严重创伤并发症的预警诊断提供新的分子标志。