不同临床表型的肝内胆汁淤积患儿ABCB11基因错义突变的功能研究

现已明确ABCB11基因突变是引起进行性家族性肝内胆汁淤积症2型（PFIC2）和良性再发性肝内胆汁淤积症2型（BRIC2）的病因。其中PFIC2较严重，患儿一般在成人前会进展为肝硬化，目前尚无有效的治疗措施。BRIC2频繁发生，GGT持续降低会进展为PFIC2。据文献报道4-丁酸苯酯（4-PBA）和剪接因子可矫正某些突变缺陷。但突变类型众多，致病机制各异，在中国患儿中检测到的突变致病机制和4-PBA及剪接因子的矫正作用未知。我们前期研究还发现预后较好病因不明的新生儿胆汁淤积症患儿也存在ABCB11基因变异，但这些变异是否是病因需进行功能研究。本项目将利用western bolt和体外细胞转染等技术研究某些错义突变的功能，阐明在中国患儿中检测到的ABCB11基因突变致病机制及4-PBA和剪接因子的矫正作用，探讨ABCB11基因突变是否会导致新生儿胆汁淤积症及其致病机制。

ABCB11基因编码的胆盐外运泵（BSEP）是肝细胞输出胆盐的主要载体，该基因缺陷会导致肝内胆汁淤积，是进行性家族性肝内胆汁淤积症2型（PFIC2）和良性再发性肝内胆汁淤积症2型（BRIC2）的致病基因。通过对25例低GGT进行性肝内胆汁淤积症患儿的ABCB11基因测序发现9例存在突变位点，且突变位点各不相同。总结我们先前报道的及台湾报道的病例，在中国低GGT进行性肝内胆汁淤积症患儿中没有找到热点突变。总结ABCB11基因变异在200例新生儿胆汁淤积症患儿和200例健康儿童中的分布发现，病例组中的变异位点要多于健康儿童组，且存在变异位点患儿的GGT水平也低于没有检出变异位点的患儿。V444A基因多态性分布在新生儿胆汁淤积症患儿和健康儿童中无显著差异，单独V444A基因变异不会增加人们对新生儿胆汁淤积症的易感性。对在进行性肝内胆汁淤积症患儿中检出的499G>A（A167T）突变和在新生儿胆汁淤积症患儿中检出的1308G>C(K436N)突变进行了功能研究。通过定点突变构建的499G>A（A167T）、890A>G(E297G)和1308G>C(K436N)三种突变质粒在hepG2细胞中能够成功表达，其中890A>G(E297G)已报道过，该突变会降低BSEP蛋白的表达。通过Western Blot 检测显示这三种突变均降低了BSEP蛋白的表达。qPCR检测结果显示这三种突变也均降低了mRNA的表达量。其中导致进行性肝内胆汁淤积症的499G>A（A167T）和890A>G(E297G)的突变蛋白和mRNA表达量要低于导致新生儿胆汁淤积症的1308G>C(K436N)突变蛋白和mRNA表达量，这也与临床表型相一致，即499G>A（A167T）和890A>G(E297G)突变导致的临床表型更重。通过对ABCB11基因突变及其功能的研究发现，该基因不同程度的变异会导致不同的临床表型，其中该基因突变也会导致新生儿胆汁淤积症为本课题首次发现。