甘氨酸受体上新型神经惊跳症致病突变的生理学致病机制及潜在药物的研究

Hyperekplexia or startle disease is caused by defects in mammalian glycinergic neurotransmission, resulting in a complex motor disorder characterised by neonatal hypertonia and an exaggerated startle reex. Although rare, this disorder canhave serious consequences,including brain damage and/or sudden infant death. This disorder is primarily caused by inherited mutations in the genes encoding the glycine receptor(GlyR) a1 subunit (GLRA1), which affect this ligand-gated ion channel in different ways. In this project, we will use whole cell patch clamp and Immunofluorescence technique to investigate some new GLRA1 Mutations in Hyperekplexia. These mutations will induce changes in GlyRs structure, function,ligand sensitivity, gating ability, and dynamics of different agonists,antagonists and channel blockers. We wili also investigate GlyR assembly,trafficing and membrane expression of these mutations. Compared these results with published Hyperekplexia mutations, we will provide insight in pathophysiological mechanisms of Hyperekplexia and function of GlyRs. We try to build new structure model and new pathophysiological mechanisms of Hyperekplexia, which will provide principle for developing drugs.

神经惊跳症是发现的第一个由编码神经递质的基因突变导致的神经运动性紊乱的人类疾病，表现为病理性过度惊吓反应和全面性僵直，会导致如大脑损伤和新生儿死亡的严重后果。目前发现该病最主要的致病原因是甘氨酸受体α1 亚基的编码基因 GLRA1 发生突变，对该配体门控离子通道蛋白的功能产生多种影响。本项目主要通过全细胞膜片钳、免疫荧光等技术，对新发现的甘氨酸受体上惊跳症致病突变进行体外克隆和表达，研究这些突变对甘氨酸受体的结构、功能、配体敏感性、门控能力的影响，对各种激动剂、拮抗剂和通道阻断剂的药理动力学变化，以及对该受体蛋白的组装、及细胞膜定位表达产生的影响。通过与国际上公开发表的致病突变体研究结果进行比较，进一步研究惊跳症相关突变的致病机理，并试图补偿恢复该受体的功能，深入研究甘氨酸受体本身的结构和功能，试图给出新的惊跳症致病机制模型和结构模型，对发现可能的靶向药物和药物结合位点提供理论依据。

神经惊跳症是发现的第一个由编码神经递质的基因突变导致的神经运动性紊乱的人类疾病，该病最主要的致病原因是甘氨酸受体α1 亚基的编码基因 GLRA1 发生突变，对该配体门控离子通道蛋白的功能产生多种影响。本项目主要通过分子生物学，全细胞膜片钳、VCF等技术，对新发现的甘氨酸受体上惊跳症致病突变进行体外克隆和表达，研究这些突变对甘氨酸受体的结构、功能、配体敏感性、门控能力的影响，对各种激动剂、通道阻断剂的药理动力学变化，研究其致病机制。研究内容（一），H109A为新发现的神经惊跳症突变。H+和Zn2+均可以在病理学条件下调节GlyR的功能，两种离子通过与GlyR细胞外激动剂结合位点H109位点结合发挥作用。我们通过六种结构不同、分子量分子体积不同的通道孔阻断剂（NA，PTX，BB，GA，GB，GC），来研究H109A突变对GlyR通道孔构象变化的影响。我们发现，阻断剂的阻断能力在H109A突变中均有减少，且该减少与阻断剂的分子量呈正相关。同时我们还发现H109A突变降低了阻断剂的阻断和去阻断效率。综上，我们提出H109A使得通道孔变“窄”，这表明H109位点变构的控制着通道孔的构象变化，H+和Zn2+的结合也可能改变了通道孔的构象。（二）在多种神经惊跳症已知突变中α1 亚基R271(19')Q突变较为常见。我们的研究发现另一个突变S21’D的引入可以使得R19’Q GlyR恢复到WT水平。有趣的是，19’Q 21’S两个位点的耦合作用影响，无论19’R 和 21’D中的一个或者两个同时引入都可以恢复GlyR的功能。我们进一步证明了21'的负电荷对这种恢复是必须的，而且21'D并不能恢复较近的24’突变和激动剂结合位点的204突变对GlyR功能的影响。接下来的VCF实验中证实了19’ 和21’ 位点间的相互作用，且该作用可能为位点特异性。根据实验结果，进一步建立新型突变对受体构象改变的模型，不仅可以深入研究惊跳症的致病机制，同时可以提供基因突变与疾病之间关系的重要线索，积极探索可能的恢复受体功能的药物和途径，对惊跳症的诊断和治疗具有重要的理论意义和临床价值。