潜在分子靶标亚洲玉米螟GroupI几丁质脱乙酰基酶结构生物学研究

Chitin deacetylases（EC 3.5.1.41，CDA）are enzymes that catalyze hydrolysis of chitin N-acetamido side chains to release acetamido groups. Insect Group I CDA1 and CDA2 play vital roles in chitinous cuticle formation. Since they are absent in human beings and higher-order animals, insect Group I CDA1 and CDA2 show great promise to be molecular targets for green pesticides. We have cloned and obtained genes encoding OfCDA1 and OfCDA2 from the model lepidopteran insect, Ostrinia furnacalis, which is known to be destructive to crops. Preliminary experiments indicated our methods of recombinant expression and crystallization of the full-length OfCDA1 and OfCDA2 were successful. This proposal focuses on OfCDA1 and OfCDA2 crystal strucutre and interactions with chitin oligosaccharide substrates. By means of single-wavelength anomalous diffraction (SAD), we will be able to overcome the lack of molecule templates for crystal resolution. Furthermore, by taking advantage of the expected crystal structures and structure-based comparisons, we expect to reveal the structural uniqueness of lepidopteran pest Group I CDAs as well as their binding mechanism to chitin substrates, and guide the rational design of small molecule insecticides for crop protection.

几丁质脱乙酰基酶（EC 3.5.1.41，CDA）催化几丁质的乙酰氨基水解脱去乙酰基。昆虫GroupI几丁质脱乙酰基酶CDA1和CDA2均在昆虫表皮几丁质形成中不可或缺，但不存在于人类及高等动物中，是潜在的绿色农药分子靶标。我们前期获得了鳞翅目模式农业昆虫同时也是危害粮食安全的害虫----亚洲玉米螟OfCDA1和OfCDA2的基因，实现OfCDA1和OfCDA2的重组表达，并初步建立OfCDA1的结晶条件。本项目申请拟通过硒代法解决昆虫CDA晶体结构解析缺少分子模板的难点，获得OfCDA1和OfCDA2以及它们与几丁质寡糖底物的复合物晶体结构，并通过结构比对和序列比对揭示鳞翅目农业害虫GroupI几丁质脱乙酰基酶的独特结构及其与几丁寡糖底物的相互作用机理，预期成果将为理性设计小分子干扰或阻碍昆虫表皮几丁质的形成，实现作物保护提供理论依据。

昆虫几丁质脱乙酰基酶(CDA, EC 3.5.1.41)催化几丁质的乙酰氨基水解生成壳聚糖，分布于表皮、气管和中肠等组织。昆虫CDA1主要在表皮中表达，可能参与新表皮中几丁质的装配过程，昆虫中肠CDAs可能参与维持围食膜的结构/形态完整性。表皮和围食膜是害虫防治中重要的作用对象，因此CDA可能是潜在的生物防治靶标，对其结构和功能研究具有重要意义。本研究在前期昆虫表皮蛋白质组工作基础上，系统地研究了昆虫外围食膜空间中的蛋白组成，发现了特有的中肠CDA。成功克隆获得了鳞翅目昆虫表皮来源CDA1，以及中肠来源CDA6、 CDA7和CDA8基因，通过基因分析和表达模式研究发现：鳞翅目昆虫CDA1具有高的序列保守性，在表皮中表达量最高，在中肠和丝腺中几乎不表达，在蛹期表达量明显升高，且表达受蜕皮激素的调控。三种中肠CDAs在不同发育时期表达水平存在差异，CDA6特异性高表达于蜕皮期，CDA7和CDA8在蜕皮期下调，而在进食期高表达，特别的，CDA8除了在进食期高表达，其在游走期具有更高的表达水平。利用基因克隆技术，在毕赤酵母表达中实现了表皮CDA1和三种中肠CDAs(CDA6, CDA7和CDA8)的重组表达，获得了高纯度的重组蛋白，CDA1能够结合胶体几丁质，但缺乏体外催化活性，但当在反应体系中添加蜕皮液，或有几丁质结合蛋白CPAP3-A1存在时，可显著提高CDA1对胶体几丁质和乙二醇几丁质的酶活力，表明CDA1发挥催化作用时可能需要其他蛋白相互作用。中肠CDA中，CDA7的酶活力最高，CDA8的酶活力较弱，而CDA6对围食膜几丁质无活力，推测CDA6可能作为几丁质结合蛋白，参与围食膜几丁质的保护，CDA7和CDA8则参与昆虫不同发育阶段的围食膜几丁质的修饰和重塑。成功获得了表皮CDA1催化结构域的晶体结构(PDB登录号5ZNS)和中肠CDA8的晶体结构(PDB登录号5Z34)，通过比较结构生物学研究揭示了其在拓扑结构和底物结合裂缝结构上的独特性，明确了CDA与底物结合的位点和作用模式，揭示了脱乙酰催化机制实现的关键残基和结构基础，为小分子抑制剂的设计筛选提供了指导，为开发几丁质脱乙酰基酶作为农药新分子靶标提供理论和研究基础。