野生狗牙根抗寒关键基因发掘和功能解析

Bermudagrass is one of the most important warm season grasses that widely used in China as turfgrass or forage grass. However, the present bermudagrass cultivars are usually not good at cold tolerance. Low temperature is considered as the key factor limiting its utilization. Wild bermudagrass is rich in stress resistance gene and can be used for the genetic improvement of bermudagrass cultivars as precious germplasm resources. We intend to undertake isolation and identification of cold resistance related nolvety genes in wild bermudagrass based on our previous study for cold tolerance germplasm screen from 404 accessions. The objectives of this study is to i) analyze the expression differences of the cold-related genes between cold resistant and low-temperature-sensitive germplasm via RNA-seq technique under normal and low temperature condistions and explore cold resistant genes in wild bermudagrass; ii) examine the polymorphism of key genes involved in cold resistance using Ecotilling technique; iii) obtain the whole length cDNA sequences of cold resistant genes with RACE and further analyze their function using transgene technique. This study will improve the understanding of the cold-resistant molecular mechanism in wild bermudagrass and promote the use of genetic resources of wild bermudagrass in cold resistant breeding.

狗牙根是我国最重要的暖季型当家草种之一，作为草坪和牧草广泛应用于我国广大地区，但目前生产上推广的狗牙根品种耐寒性较差，低温被公认为是限制狗牙根利用范围的主要因素。野生狗牙根蕴藏着丰富的抗逆基因，是狗牙根品种遗传改良的珍贵种质资源。本研究以前期从404份狗牙根材料中筛选出的野生狗牙根特异抗寒种质为材料，以发掘克隆抗寒新基因为目标,利用新一代高通量RNA测序技术（RNA-seq），在低温和正常条件下，比较抗寒和低温敏感种质间抗寒相关基因表达丰度的差异，并用Ecotilling技术鉴定一批抗寒相关基因的多态性，发掘与狗牙根抗寒性密切相关的关键基因，进而用RACE技术克隆5-10个抗寒关键基因的全长cDNA序列，构建真核表达载体，通过转基因验证这些基因的功能，从而明确野生狗牙根种质抗寒的分子机理，促进野生狗牙根基因资源在植物抗寒育种中的利用。

狗牙根是我国最重要的暖季型当家草种之一，低温被公认为是限制狗牙根推广应用的主要因素。野生狗牙根蕴藏着丰富的抗逆基因，是狗牙根品种遗传改良的珍贵资源。本项目主要研究野生狗牙根种质资源耐寒性评价、抗寒基因发掘与功能鉴定。我们建立了野生狗牙根种质耐寒表型数据库，并从中筛选了10余份极端耐寒种质和5份对低温敏感种质。以耐寒和低温敏感狗牙根种质为材料，利用RNA-Seq结合生理生化技术，在低温胁迫和正常温度条件下，分析了全基因组水平上基因的差异表达情况，发掘了一批参与狗牙根应答低温胁迫的基因，其中包括一些在耐寒种质中特异表达或优势表达的关键基因。研究还揭示了狗牙根耐寒种质相比低温敏感种质，能够更快地调节基因表达来应答低温胁迫；经过4 °C低温驯化后，狗牙根耐寒种质能够更加有效地激活基因表达来应答冷冻胁迫（零下低温）；差异基因富集的代谢通路分析揭示狗牙根可能通过激活光和代谢、氮代谢、碳固定、脂类代谢、糖代谢以及激素信号转导等通路来应答低温胁迫。利用RACE技术克隆了一批耐寒关键基因，如CdERF1、CdCAMTA1等，通过超表达和VIGS等手段对这些基因进行了耐寒功能鉴定，发现CdERF1、CdCAMTA1超表达植株的耐寒能力明显强于WT，而CdCAMTA1-VIGS和CdERF1-VIGS的狗牙根植株耐寒能力则明显低于对照。进一步利用RNA-Seq技术，分析了WT和CdERF1-VIGS狗牙根在低温胁迫下的差异基因表达模式，结果显示CdERF1-VIGS狗牙根中下调的基因，主要涉及光合作用、不饱和脂肪酸合成、谷胱甘肽代谢和碳代谢等过程，表明CdERF1通过调节这些途径来应答低温胁迫。我们研究还揭示了激素和小分子物质，包括乙烯、一氧化氮和褪黑素，通过调节光合系统、抗氧化系统、代谢物质合成和关键基因表达来调节狗牙根耐寒性。此外，基于关联分析策略，我们发掘到15个SSR位点与狗牙根耐寒性紧密相关联，并且有10个位点与多个功能性状相关联，为狗牙根抗寒分子育种提供了重要科学依据。本项目为第一标注发表SCI论文8篇，取得重要研究进展，达到预期研究目标，为狗牙根抗寒分子育种提供了有价值的科学资料。