人胚胎干细胞联合脱细胞猪角膜基质构建三维全层生物角膜

Corneal disease is the second reason responsible for sight loss worldwide.Corneal transplantation is the most effective treatment for corneal blindness at present, but the shortage of donor corneas is a big obstacle worldwide. Bioengineered cornea has affluent sources and good biocompatibility, which make it an ideal substitute for donor cornea..The construction of bioengineered cornea is to plant the seeding cells (corneal epithelial, stromal and endothelial cells) to a scaffold,and the bioengineered cornea should have similar structure and function to the natural one. We have already aquired acelluar porcine corneal matrix as an ideal scaffold in our previous research,which was applied in the construction of rabbit anterior corneal lamella and human posterior corneal lamella; we also successfully induced human embryonic stem cells to differentiate into corneal limbus stem cell-like cells, which is suitable for bioengineered corneal epithelial construction;the induction of rat neural crest stem cells to corneal endothelial cell-like cells was also a success, which set research base for human corneal endothelial cell-like cells in the future.This project intends to explore the proposal to induce human embryoinc stem cells to differentiate into corneal endothelial cell-like cells;to construct 3-dimensional full-thickness bioengineered cornea using corneal limbus stem cell-like cells, corneal endothelial cell-like cells and human stromal cells together with acellular porcine corneal matrix, the structure and function of this bioengineered will also be evaluated for future clinical use.

角膜盲是全球第二大致盲眼病，同种异体角膜移植是目前治疗角膜盲最有效的手段，但角膜供体极度匮乏难以满足手术病人的需要。生物工程角膜材料来源丰富，组织相容性好，是优良的角膜替代物。生物工程角膜的构建是将体外扩增的种子细胞种植于支架材料上，经过体外三维培养，形成与正常角膜结构和功能相似的人工角膜。目前本课题组已成功完成脱细胞猪角膜支架的制备及兔角膜前板层、角膜后板层模型的构建；并在人胚胎干细胞诱导分化为角膜缘干细胞样细胞及大鼠神经嵴干细胞诱导分化为角膜内皮样细胞方面取得了突破性的进展，为今后人角膜内皮细胞的诱导奠定了基础。本项目将深入研究人胚胎干细胞向角膜内皮细胞诱导分化的方案，以期获得功能性角膜内皮细胞样细胞；以角膜缘干细胞样细胞、角膜内皮细胞样细胞及人角膜基质细胞为种子细胞，联合脱细胞猪角膜基质构建三维全层生物工程角膜，并进行全面的形态及功能评价，为下一步的临床应用奠定理论及技术基础。

角膜盲是全球第二大致盲眼病，同种异体角膜移植是目前治疗角膜盲最有效的手段，但角膜供体极度匮乏难以满足手术病人的需要。生物工程角膜材料来源丰富，组织相容性好，是优良的角膜替代物。生物工程角膜的构建是将体外扩增的种子细胞种植于支架材料，经过体外三维培养，形成与正常角膜结构和功能相似的人工角膜。本课题组前期已成功完成脱细胞猪角膜支架的制备及兔角膜前板层的构建，并在大鼠神经嵴干细胞诱导分化为角膜内皮细胞样细胞方面取得了突破性的进展。本课题在2013－2016年度顺利按照原计划进行，现已完成计划内容。本项目首先成功将人胚胎干细胞（hESCs）诱导分化为角膜缘干细胞样细胞（LSCs-like cells），将联合脱细胞猪角膜基质（APCM）构建的组织工程LSCs植片移植入LSCs缺损模型，证实组织工程LSCs植片可重建角膜缘微环境、修复眼表损伤。我们进一步优化了角膜上皮细胞的诱导方法，利用无异种成分、不依赖原代LSCs的方法将hESCs诱导分化为与LSCs形态和功能相似的角膜上皮祖细胞（CEPCs），联合脱细胞猪角膜缘基质（APLM）构建了组织工程角膜移植物，通过形态学及免疫学分析证实APLM可支持CEPCs的粘附生长及特性的维持，为修复眼表损伤提供了新方案。我们还利用人角膜上皮和基质细胞联合APCM为支架构建了组织工程角膜前板层，证明人角膜细胞与APCM具有很好的组织相容性。我们开创了hESCs向角膜内皮细胞样细胞（hCEC-like cells）的诱导分化方案，成功获得了功能性的hCEC-like cells，并联合APCM构建组织工程角膜后板层，经体内外实验证实组织工程角膜后板层可修复角膜内皮功能失代偿模型。最后，我们及以角膜缘干细胞样细胞、角膜内皮细胞样细胞及人角膜基质细胞为种子细胞，联合APCM探索了构建三维全层生物工程角膜的方法，对构建的全层角膜进行全面的形态及功能评价，并进行了兔及灵长类动物角膜移植实验，这为进一步的基础研究及临床应用奠定理论及技术基础。