TLR4-NOD2"双识别"调控角膜真菌感染的机制

真菌角膜感染是常见的严重致盲眼病，有效调控角膜抗真菌免疫是从根本上防治角膜真菌感染的关键。近年研究发现机体存在胞内模式识别受体NOD蛋白家族，以"细胞内监测"方式启动抗细菌天然免疫，并和TLR在传递信号时"交叉对话"，相互协调共同调控免疫反应。我们前期研究发现角膜上皮细胞表达NOD2、TLR4-NOD2可能有协同作用。本课题将在初步研究基础上以TLR4、NOD2为研究靶点，以人角膜上皮细胞和wistar大鼠为研究对象，检测烟曲霉菌刺激后NOD2及相关信号分子、炎性因子、抗菌肽等的表达变化，并通过分别及联合阻断TLR4、NOD2基因表达，观察烟曲霉菌刺激反应的变化，验证二者构成"双识别"系统参与角膜识别真菌并协同调控角膜抗真菌感染的作用。通过明确NOD2在角膜抗真菌感染中的作用及其与TLR4的相互关系，为角膜抗真菌免疫机制及防治真菌角膜感染提供全新的理论。

角膜真菌感染是常见的严重致盲眼病，有效调控角膜抗真菌免疫是从根本上防治角膜真菌感染的关键。NOD1、2受体蛋白是NOD样受体家族中的重要成员，也是内在免疫系统的关键受体，主要位于胞浆中。我们前期研究发现人角膜上皮细胞能基础表达NOD1、NOD2以及TLR2。在我们的研究中，NOD1, NOD2的特异性配体DAP, MDP刺激人永生化角膜上皮细胞能够促进NOD1, NOD2的表达，并且促进了NOD1，NOD2介导的下游信号分子RIP2 和 NF-κB p65的表达以及炎性因子TNF-α, IL-6, IL-8和抗菌肽hBD2, LL37的分泌。烟曲霉菌孢子刺激体外培养的THCEs, 不同时间点后收取细胞。RT-PCR, WB 结果显示NOD1及其下游信号分子RIP2 和 NF-κB p65的表达明显增高，炎性因子和抗菌肽的分泌也同时增加。我们进一步的研究发现，用小干扰RNA阻断NOD1后，用DAP或烟曲霉菌孢子刺激THCEs，RT-PCR, WB 结果显示炎性因子、抗菌肽的分泌减少以及NF-κB p65的活性被阻断。因此，我们的研究揭示，NOD1是人角膜上皮细胞抗真菌天然免疫防御系统中的重要一员，通过NF-κB通路启动天然免疫反应。在我们的研究中，我们发现灭活的烟曲霉菌孢子刺激THCEs后，NOD2和TLR2的表达都增高。我们发现TLR2的配体酵母聚糖能够促进NOD2和RIP2的表达，但是用酵母聚糖刺激THCEs一段时间后，再用MDP刺激THCEs，NOD2，RIP2的表达降低连同炎性因子以及抗菌肽的分泌减少。而且我们发现灭活的烟曲霉菌孢子刺激THCEs后，部分地通过TLR2介导的信号通路来促进NOD2, RIP2 和 IκB-α的表达增高。用小干扰RNA阻断NOD2后，并不影响灭活的烟曲霉菌孢子诱导的炎性因子的释放。我们的研究证明在角膜的抗真菌天然免疫反应中，NOD2和TLR2之间有复杂的相互作用，二者构成“双识别”系统参与角膜识别真菌并协同调控角膜抗真菌感染的作用，从而为角膜抗真菌免疫机制及防治真菌角膜感染提供全新的理论。