在骨髓间充质干细胞过表达CX3CL1 与Wnt3a基因调节小胶质细胞活性促进神经元再生

Alzheimer's disease (AD) patients suffer from irreversible injuries in cognition and memory because of the aggregation of abnormal proteins and over-activated microglia. Recent evidence support that the decrease in CX3CL1/CX3CR1 signaling pathway is associated with over-activated microglia and hippocampal neurons injures. Our recent studies also showed that regulation of over-activated microglia facilitate the survival of neurons. Therefore, it is meaningful to regulate CX3CL1/CX3CR1 signaling pathway in neuroinflammation and neurogenesis in AD. In this proposal, using luciferase reporter system, we attempt to screen the signal proteins that upregulate CX3CR1 gene expression. We will use lentiviral- trangentic vector system to overexpress CX3CL1 and Wnt3a in BMSCs, and then explore the regulation of Aβ protein-induced pro-inflammatory factor TNF- α, IL-1 β and IL-6 by genetically modified BMSCs. In vitro, we will analyze the expression of neural progenitor cell markers Sox2, Nestin and DCX, and proliferation cell markers Ki67 and EdU incorporation by confocal, and then evaluate the effect of genetically modified BMSCs on the regulation of differentiation and proliferation in neural progenitor cells. In vivo, we will transplant genetically modified BMSCs into hippocampus in APP/PS1 transgenetic mice to study neurogenesis in hippocampus. Furthermore, the changes in memory and behavior after transplantation will be studied. This proposal using stem cells to deliver therapeutic proteins, and combining the inhibition of neuroinflammatory injuries and induction of neurogenesis will provide a new therapeutic strategy for AD.

研究表明，小胶质细胞的过度激活是阿尔茨海默病（AD）的重要发病机制之一，而趋化因子（C-X3-C基元）配体1(CX3CL1)的信号衰减与小胶质细胞的活化和海马神经元的损伤密切相关。我们前期研究已证实，上调Wnt3a基因可增加趋化因子受体1 （CX3CR1）的表达，通过调控小胶质细胞活性可减轻神经炎症有助于神经再生。因此，本项目拟在骨髓间充质干细胞（BMSCs）以慢病毒为载体高表达CX3CL1 与Wnt3a基因，与小胶质细胞共培养，探讨BMSCs对Aβ诱导的小胶质细胞活化调节作用；采用荧光共聚焦技术，探讨Aβ诱导下高表达CX3CL1与Wnt3a基因的BMSCs对海马神经祖细胞增殖与分化的调控作用；并移植入AD模型转基因小鼠海马，检测神经再生以及小鼠记忆和行为学改变。通过干细胞传递治疗性蛋白方法，将抑制神经炎症与促进神经再生作用相结合防治AD，拟为AD的防治提供重要的理论基础和新的治疗策略。

阿尔兹海默病是一种最为常见的痴呆疾病，目前尚无有效的治疗方法，而基于基因与干细胞的新的治疗方法有望成为改善神经退变疾病更为有效的手段。. 研究表明，CX3CL1/CX3CR1也被认为AD病程中参与小胶质的调节，淀粉样蛋白的清除和神经突触的可塑性。而Wnt3a作为Wnt信号分子经典通路的上游基因，参与中枢神经细胞的再生，并通过作用下游靶基因促进细胞存活，发挥着神经保护作用。因此，本研究设想CX3CL1 和Wnt3a基因共修饰的BMSCs一方面调节小胶质细胞的活化作用，促进Aβ清除，改善神经元微环境；另一方面又可促进神经细胞存活，发挥神经保护作用；将抑制神经毒性与促进神经保护有效的相结合，进而最终实现改善AD的记忆损伤、行为学改变等临床症状的作用。本实验将从两个方面入手，一方面是研究Wnt3a-CX3CL1双基因转染的MSC移植治疗AD小鼠的作用；另一方面是探索Wnt3a-CX3CL1双基因转染MSC治疗AD小鼠的机制。. 结果： 1.Wnt3a-CX3CL1 双基因转染的MSC经侧脑室移植入APP/PS1小鼠脑内，明显改善其认知功能，对小鼠痴呆症有显著的防治作用； 2.Wnt3a-CX3CL1 双基因转染的MSC经侧脑室注射入APP/PS1小鼠脑内，可能通过上调IGF-1的表达水平，其作为IDE的上游信号分子，介导PI3K-AKT信号分子，促进IDE合成与活性，增强对Aβ42的清除能力，减少其在脑内蓄积所引起的神经毒性，改善脑内神经元的微环境，进而保护神经突触； 3. Wnt3a联合CX3CL1信号分子共同抑制GSK3β的活性，促进下游信号分子β-catenin进入细胞核，激活下游靶基因，发挥细胞保护作用，提升过表达Wnt3a-CX3CL1的MSC对 APP/PS1 小鼠神经退行性病变的治疗效果。 4.BMSCs移植可以调控神经炎症因子分泌，促进神经保护因子和突触蛋白的表达以及改善APP/PS1小鼠的学习记忆能力. 以上研究结果表明，双转基因修饰干细胞（Wnt3a-CX3CL1-MSC ）在治疗 AD 中效果显著，能够有效改善认知障碍，为基因联合干细胞防治老年性痴呆在临床上的应用提供了重要的理论依据和实验基础，具有重要的理论意义和实际应用前景。