Wnt3a影响骨髓间充质干细胞修复软骨缺损的研究

Multilineage commitment of Mesenchymal stem cells (MSCs) is carried out different mechanisms. The Wnt proteins are a group of secreted lipid-modified signaling proteins that activate various pathways in the cell that can be classified as the canonical and noncanonical Wnt pathways. These pathways play a variety of important roles in direction of differentiation and potency of differentiation. In this study, we want to construct the Wnt3a lentivirus vector and Wnt3a-shRNA lentivirus vector. These virus can infect the Rats MSCs and by these system, we investigated the effects of upregulated Wnt3a and downregulated Wnt3a on proliferation and differentiation of chondrogenesis. Addition, we also can study the mechanism of above result. Then,we want to replant the MCSs that infected by Wnt3a-expressing lentivirus to rats model of cartilage defects and observe the information of repair in cartilage defects. We believe our study can provide a theoretical evidence and a new thread for repairing of cartilage defects.

骨髓间充质干细胞分化为多种细胞的过程，有很多的因素参与调控。其中Wnt信号通路在控制骨髓间充质干细胞的分化方向和早期分化潜能方面起着重要作用。本试验试图通过体外构建Wnt3a和Wnt3a-shRNA慢病毒载体，并分离大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs），经病毒转染后研究MSCs增殖、凋亡和向软骨细胞分化的情况并初步探讨其可能的机制，为Wnt3a在骨与关节损伤治疗方面提供理论依据；进而将过表达wnt3a的MSCs植入大鼠软骨损伤模型体内，观察软骨损伤修复情况，以期能进一步为关节损伤的治疗探索一个新的思路。

由各种原因引起的关节软骨损伤甚至缺损导致关节功能障碍是骨科的常见疾患。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是软骨修复过程中常用的种子细胞，其受Wnt3a信号通络影响，一定程度上决定了其分化方向，但相关作用机制仍不明确，本实验的目的为观测Wnt3a过表达后骨髓间充质干细胞（BMSCs）成软骨能力的变化，以及Wnt3a影响BMSCs增殖、分化的相关机制。. 结果： Wnt3a转染BMSCs后，其基因能够表达。MTT分析显示过表达Wnt3a的BMSCs增殖率显著高于对照组（P<0.05）； BMSCs中Wnt3a的过表达降低了基质蛋白聚糖的积累；Wnt3a表达上调同时导致COL2A1、 Aggrecan和 SOX9的mRNA水平显著降低（P<0.05）。Wnt3a的过表达造成了经典途径特异性标志物β-catenin的上调；在过表达Wnt3a BMSCs的细胞质中Ca2+浓度升高（P<0.05），并导致磷酸化CaMKII浓度升高（P<0.05），而对内源性CaMKII的表达无影响。阻断经典途径后发现，BMSCs的增殖回归自然水平，但基质蛋白聚糖进一步减少， COL2A1、Aggrecan和 SOX9的mRNA保持在低水平；阻断非经典途径后发现，BMSCs的增殖能力不受其影响，而且基质蛋白聚糖显著增加， COL2A1、Aggrecan和 SOX9 mRNA的水平显著上调（P<0.05）。. 结论：（1）Wnt3a增强了BMSCs的增殖。（2）Wnt3a抑制了BMSCs的成软骨分化。（3）Wnt3a激活了MSC中的经典途径。（4）Wnt3a能够激活非经典的Ca2+/CaMKII信号途径。（5）Wnt3a可通过经典Wnt途径促进BMSCs的增殖，但主要通过非经典的Ca2+/CaMKII途径抑制BMSCs的成软骨分化。（6）经典途径阻断剂DKK1与Wnt3a在抑制BMSCs成软骨分化的过程中发挥了协同作用。. 本研究立足于基因技术，围绕软骨损伤、Wnt3a通道蛋白和骨髓间充质干细胞，旨在研究Wnt3a对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响及相关机制，为利用Wnt这一新兴的通道蛋白治疗软骨损伤提供新的理念和理论基础。