滋阴益气活血法调控GLP-1促进胰岛β细胞增殖、抑制凋亡的分子机制

肠道L细胞分泌的胰高血糖素样多肽-1(GLP-1)是迄今唯一发现的与胰岛β细胞增殖呈正相关的激素，其能通过cAMP→PI3K等信号途径促进胰岛β细胞增殖、抑制凋亡而改善β细胞功能。本课题组前期比较实验研究发现，依据中医滋阴益气活血法则研制的石斛合剂，具有明显的促进胰岛细胞增殖、改善胰岛细胞质量等良性变化，且与GLP-1水平变化呈正相关，但两者的相互关系及该方药作用的分子机制有待进一步探明。本项目根据糖尿病研究的最新报道，拟用GK模型大鼠行整体动物实验和胰岛细胞含药鼠血清培养法，观察石斛合剂对GLP-1的调控和对GLP-1介导的胰岛B细胞增殖、凋亡信号通路变化的影响，以揭示该方药作用的肠道下端靶点、阐明其调控GLP-1与胰岛细胞良性变化的分子机制，对指导临床运用滋阴益气活血法有效防治2型糖尿病有重要的理论意义和实用价值。

本课题研究按计划完成，选用主要功能为滋阴益气活血泻浊的石斛合剂序贯疗法（含1、2号方）在整体、细胞水平进行研究，发现该疗法具有提高糖尿病模型大鼠血清胰岛素，降低胰高血糖素水平，调整血脂，提高禁食及高糖负荷后GLP-1水平，胰腺病理显示其使胰岛形态结构恢复，INS分泌明显增多（胰腺INS特染），GLP-1R分布较为均匀，且染色呈强阳性(PAS染色)，小肠下端GLP-1免疫组化显示石斛合剂序贯方组小肠GLP-1分泌明显增多；western-blot结果显示其能增加GLP-1R、IRS、PI3K/Akt、PDX-1及Bcl-2等蛋白表达，降低FoxO1/FOxa2、Caspase、Bax等表达；β-TC-6细胞（经Exendin9-39干预）实验发现，采用石斛合剂序贯方含药血清孵育后，CAMP、GLP-1R、β-Catenin、Pdx-1等表达较模型组明显上升。以上结果提示石斛合剂序贯方通过增加血GLP-1水平，提高胰岛β细胞GLP-1R表达，IRS、PI3K/Akt、β-Catenin蛋白表达，降低FoxO1/FOxa2，增加PDX-1表达，促进胰岛β细胞增生；抑制凋亡信号通路中的凋亡因子Caspase、Bax表达、促进抗凋亡因子Bcl-2表达以逐步恢复胰岛β细胞数量和功能。另外肝肾组织病理检查显示其能明显改善肝肾组织结构功能，抑制纤维化；用高浓度胰岛素刺激HepG2细胞24h，InsR mRNA和蛋白质水平明显下降，较生理高胰岛素刺激的对照组显著降低，再加入10%含药血清继续培养48h，InsR mRNA和蛋白质表达比高浓度胰岛素组有明显提高；采用石斛合剂序贯方含药血清进行干预胰岛素抵抗肝细胞模型，发现胰岛素敏感指数较模型组明显提高，INS-R、PI3K、AKT及P-AKT等蛋白的相对表达量较模型组显著增加，加入PI3K抑制剂Wortmannin后各组的胰岛素敏感指数较对照组均明显降低，各组的P-AKT相对表达量均减少。基因检测肝组织显示：衰老糖尿病模型大鼠与正常组存在差异的已知功能基因1339个，用药后近千个基因表达量恢复正常，从基因转录组学角度证实了该疗法在动物模型体内产生的分子效应。该研究已发表7篇文章，其中2篇SCI收录，3篇属国内核心期刊，有1人次参加国际会议，并做小组报告，获国家发明专利1项。