苹果树腐烂病菌侵染过程基因的差异表达及致病性研究

苹果树腐烂病是我国苹果生产中的重大毁灭性病害，已对该产业的发展构成了严重威胁。由于对病菌致病机理知之甚少，对病害发生规律认识粗浅，致使病害防治工作低效、盲目、被动。因此，加快解析病菌的致病机制具有重要的理论意义和实际价值。本项目拟通过RNA-Seq技术和生物信息学方法对腐烂病菌接种苹果嫩梢后不同时间点的全转录组进行系统分析，以揭示病菌致病过程中基因表达特征及规律；再挑选特异表达基因并利用qRT-PCR技术鉴定候选致病基因；然后利用建立的PEG介导的病菌遗传转化体系获得目标基因的同源重组敲除突变体，并进行突变体互补试验，明确目标基因的功能；通过目标基因与GFP基因融合表达进行定位分析；进而用突变体和野生型菌株接种苹果嫩梢明确致病性变化情况，以揭示目标基因在病菌致病过程中的作用，从而为全面解析苹果树腐烂病菌致病的分子机制奠定基础，以便为有效控制该病害的方法技术和药剂研发等提供物质和理论依据。

苹果树腐烂病是我国苹果生产中的重大毁灭性病害，已对该产业的发展构成了严重威胁。由于对病害发生规律认识粗浅，加之对病菌致病机理知之甚少，致使病害防治工作低效、盲目、被动。本项目通过RNA-Seq技术和生物信息学方法对腐烂病菌Valsa mali接种苹果嫩梢后不同时间点的全转录组进行系统分析，鉴定获得菌丝体和病组织中差异表达的基因437个，其中139个基因在病组织中明显上调（Fold change>2）。GO和KEGG富集分析表明，病菌的次生代谢产物合成以及细胞壁水解等相关基因在病菌侵染过程中表达活跃。对139个侵染过程中上调表达的基因进行归类，共发现11个编码糖基水解酶的基因，包含糖基水解酶家族28（果胶酶）、11和43（半纤维素酶）、12和3（纤维素酶），以及果胶酶（果胶酯酶、果胶裂解酶），其中果胶酶类在病菌侵染中相对表达量最高。同时结合V. mali 和V. pyri 的基因组结构特征及差异分析，发现水解酶等相关基因的扩增及次生代谢相关基因（簇）的变异是导致其适应性定殖树皮、引致树皮溃烂和寄主偏好性差异的主要决定因子。因此，选择13个果胶酶类基因（5个内切多聚半乳糖醛酸酶、4个外切多聚半乳糖醛酸酶、4个果胶裂解酶），利用本实验室建立的PEG介导的遗传转化体系获得了9个目标基因（3个内切多聚半乳糖醛酸酶、4个外切多聚半乳糖醛酸酶、2个果胶裂解酶）的同源重组敲除单拷贝突变体，并对有显著表型差异的突变体进行了基因互补以及过表达试验，明确了基因的生物学功能，发现2个内切多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7、Vmpg8，4个外切多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpgx1、Vmpgx2、Vmpgx3、Vmpgx4以及1个果胶裂解酶基因Vmpl4在病菌的致病过程中具有重要作用，另外发现1个果胶裂解酶基因Vmpl1可能为病菌致病负调控因子。此外，根据转录组信息，对2个己糖激酶基因以及1个GTP-环化水解酶II基因进行了生物学功能分析，发现己糖激酶Vmgxk1和GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1对病菌的致病性具有重要作用。研究结果加快了病菌的致病机制解析，进而为有效控制该病害的方法技术和药剂研发等提供物质和理论依据。