AP-1B/clathrin蛋白复合体调控TJ蛋白膜定位对肠屏障功能的作用研究

Tight junction(TJ) play a key role in the maintance of intestinal barrier function(IBF). Most of previous studies about IBF impairment focus on the expression of TJ proteins. Recently, we have demonstrated that the .membrane localization of claudin-1/4 have changed in a model of loss of IBF, which implys that the membrane localization of TJ proteins may play an improtant role in the loss of IBF, however the mechanism is not clear. Another study has identified the expression of adaptor protein-1B(AP-1B) is reduced when IBF is impaired. AP-1B usually integrates with clathrin and clathrin is closely related to TJ proteins membrane localization.Is the IBF defects not only due to the decreased expression of TJ proteins, but also due to altered TJ protein membrane localization related to AP-1B/clathrin complex? Therefore, this study will investigate the role of altered TJ protein membrane localization in the loss of IBF both in vivo and in vitro models, by using the methods of Gene overexpression, RNA interference, western blot, immunohistochemistry, laser confocal microscopy technique and so on. Thus, this study will inaugurate a new way for the research of IBF injury mechinism and its prevention.

紧密连接（TJ）在肠黏膜屏障功能（IBF）的维护中起着关键作用。既往研究多关注TJ蛋白表达变化对其影响，近来我们研究发现TJ蛋白claudin-1/4膜定位异常可能参与了IBF损伤，但其具体机制仍不清楚。新近研究表明，分选极化因子AP-1B与网格蛋白clathrin组成的AP-1B/Clathrin蛋白复合体可能在TJ蛋白膜定位机制中扮演关键角色。因此我们推测：多种病理刺激不仅引起TJ蛋白表达变化，还通过AP-1B/Clathrin复合体，引起TJ蛋白膜定位的异常，从而影响IBF。本研究拟采用体内外IBF受损模型，通过调节（基因沉默或过表达）AP-1B、Clathrin蛋白表达，利用WB、IHC、CLSM及尤斯灌流系统等，研究AP-1B/Clathrin复合体所致的TJ蛋白膜定位异常对IBF的影响，为IBF的损伤防治提供新的研究策略及靶点。

紧密连接（TJ）在肠道屏障功能的维护中具有关键作用。紧密连接蛋白的表达水平及亚细胞定位的变化均能影响紧密连接的完整性。AP-1B是一种特异性表达于上皮细胞的衔接蛋白，对特定膜蛋白的基底侧分选具有关键作用。Par-3是一种细胞极性蛋白，在紧密连接的形成过程中具有重要作用。本项目通过建立的体内及体外疾病模型，初步揭示AP-1B与Par-3对TJ蛋白表达与定位的影响，明确AP-1B与Par-3对肠上皮屏障功能的调控作用，并探讨其机制，为肠黏膜屏障损伤防治提供新的研究策略及靶点。在该项目的资助下共发表SCI论文11篇，部分研究内容作为报奖材料的一部分，获得2014年重庆市自然科学一等奖。主要研究结果如下：.1..构建体外肠上皮屏障（IEB）损伤模型，观察TJ蛋白及跨上皮电阻的变化。发现缺氧及TNF-α刺激后，上皮细胞屏障通透性增加，TJ蛋白zo-1，occludin及claudin-1胞膜表达下降。证实急慢性IEB损伤模型中TJ蛋白表达及分布的变化是肠屏障功能损伤的重要机制。.2..研究AP-1B对TJ 蛋白的调控作用，发现体外IEB损伤模型中AP-1B的表达显著下降。AP-1B的缺失后，TJ蛋白zo-1，occludin及claudin-1膜表达无明显变化，但是claudin-2的膜表达显著增加。初步揭示AP-1B可通过调节TJ蛋白claudin-2来调控肠上皮屏障功能。.3..构建体内外炎症损伤模型，观察TJ蛋白及Par-3蛋白的表达与分布变化。发现DSS诱导的小鼠肠炎中结肠zo-1与occludin表达下降，并观察到occludin于胞浆分布。同时在DSS诱导肠炎与TNF-α刺激的肠上皮细胞中均观察到Par-3蛋白表达下降。.4..研究Par-3对肠屏障功能的调控作用，发现Par-3的缺失可阻断occludin的高尔基体-膜转运，活化MLCK-pMLC信号通路，促进结肠癌上皮细胞系Caco-2对TNF-α的敏感性。阐明了Par-3参与维持肠屏障功能稳定的分子机制。