果蝇RNA结合蛋白FNE和RBP9在神经系统中的功能研究

As one of the important regulators of post-transcriptional regulation of gene expression, RNA binding proteins play pivotal roles from assembly to function in all organisms. In multicellular animals, ELAV/Hu family is a group of pan-neuronal RNA-binding proteins that contain three RRMs (RNA recognition motif), and are highly conserved in the nervous system. In mammalians, many studies show that these proteins dysfunction are involved in neurodevelopmental disorders as well as neurodegenerative disorders. In model system Drosophila melanogaster, this family contains ELAV, RBP9 and FNE. The elav (embryonic lethal abnormal visual system) gene is the first identified, and essential for the neuronal differentiation and maintenance. elav encodes a vital protein that regulates the neuronal alternative splicing of some genes. It is reported that RBP9 (RNA binding protein 9) protein plays important roles in cystocyte differentiation; FNE (Found in neurons) is involved in the courtship behavior. While the molecular functions of RBP9 and FNE in nervous system are little known. In order to figure out the molecular regulatory functions of FNE and RBP9, first, we identify the specific binding sequences and proteins of FNE and RBP9 by using UV-CLIP and mass spectrometry respectively. Second, target genes regulated by FNE and rbp9 are identified by transcriptomic analyses. Finally, the functions of FNE and RBP9 during development are illustrated by genetic and behavior methods. The project takes RNA expression regulation as the joint of the nervous system and behavior study, which will expand the content of cognitive behavior in animals and the study of human neuronal diseases.

RNA结合蛋白是基因表达转录和转录后调控的重要因子之一，在生物体各组织器官发生与功能中起着重要作用。多细胞动物中，ELAV/Hu是一类含有3个RRMs、高度保守的神经RNA结合蛋白家族。哺乳动物中较多研究发现，该家族蛋白异常或功能缺失与神经发育异常及神经性疾病相关。在经常用于人类疾病模型的果蝇中，该家族包括ELAV、RBP9和FNE。ELAV最早被发现,主要参与神经分化与维持，并调控神经系统中靶标基因的选择剪接；RBP9与FNE虽有少数研究，但二者在神经系统中的功能还不清楚。因此本课题将结合利用有效的生化方法、新的Cas9基因编辑技术、高通量测序、生物信息分析及遗传表型分析等方法，从结合靶标序列、互作蛋白、调控的靶标基因及生长发育中作用等多方面深入研究果蝇神经系统中的FNE和RBP9，为果蝇疾病模型在人类ELAV/Hu相关疾病的研究中的合理利用提供更明确的研究基础。

在多细胞生物中，ELAV / Hu是一类含有3个RRMs、高度保守的神经细胞RNA结合蛋白家族。在果蝇中该蛋白家族包括ELAV、RBP9和FNE，其中ELAV主要参与神经系统的发育分化，调控神经系统中靶标基因的选择性剪接；而RBP9和FNE在神经系统中的功能尚未明确。在鳞翅目家蚕中该家族蛋白研究甚少。本研究一方面利用CRISPR/Cas9技术，成功获得Vfne和3Frbp9转基因果蝇品系。利用遗传杂交实验，构建了Vfne;3Frbp9果蝇品系。通过pull down方法富集RBP9，经质谱检测，鉴定得到190个特异与RBP9可能存有相互作用的蛋白质。经GO分析，发现这些蛋白质主要参与了核小体、染色质组装、线粒体合成等生物学过程；KEGG分析显示，这些互作蛋白主要参与碳代谢、核糖体、柠檬酸循环和氨基酸的生物合成等通路。由此推测RBP9通过与这些蛋白质相互作用，在基因转录、转录后调控、翻译等过程起着重要的调控作用。利用CoIP技术检测到RBP9与FNE在神经系统中存在相互作用，与质谱检测结果相一致，同时二者存在必需遗传相互作用，表明RBP9与FNE的相互作用在果蝇生长发育中具有重要的意义。利用RNA-Seq方法，将FNE功能完全缺失的突变体的头部进行转录组学研究，揭示FNE在神经系统中对基因的转录水平和选择性剪接水平上具有调控作用，且该调控作用具有性别特异性；对差异表达基因进行GO分析发现部分基因涉及神经突触、突触囊泡循环及神经递质释放等过程，由此推测在神经系统中，fne可能在神经突触发生过程中具有重要作用。另一方面，家蚕中Bmel-1和Bmel-2具有不同的时空表达谱，Bmel-1表达于整个发育周期，且在各组织中均有表达；Bmel-2在胚胎后期以及幼虫前期具有低量表达，仅在头部和卵巢中特异性表达；二者突变后对家蚕体重、茧质性状具有明显影响；二者对丝蛋白的表达具有重要的调控作用。本研究通过对ELAV RNA 结合蛋白家族在双翅目果蝇和鳞翅目家蚕中生物学功能研究，揭示该家族蛋白生物学功能存在进化与保守，为该家族在不同物种中的功能研究提供借鉴意义。