Notch配体介导类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞调节Th17细胞增殖分化的实验研究

Th17细胞在关节局部的增殖与分化是引起类风湿性关节炎（RA）局部炎症的关键因素，但其中具体的调节机制仍不明确。本项目在前一个国基金发现T细胞自身特定的Notch受体分子参与胶原特异的Th17细胞分化的基础上，进一步提出关节局部增生的滑膜成纤维细胞（FLS）可能通过提供外部Notch信号配体调节Th17细胞增殖分化的工作假说。拟首先通过定量PCR、免疫组化及免疫荧光分析RA FLS与CIA小鼠滑膜 Notch配体表达量/谱的改变。再观察Notch配体融合蛋白、经细胞因子刺激的、转染或经RNA干扰Notch配体表达的FLS对Th17细胞体外扩增及功能的影响。结合Notch配体的干扰质粒或阻断剂对关节炎小鼠模型的治疗作用，探寻FLS调节Th17细胞增殖分化过程中起关键作用的Notch信号分子。本项目将进一步证明Notch信号在RA发病机制中的重要作用，为发展基于该途径的免疫治疗提供理论依据。

Th17细胞在关节局部的增殖与分化是引起类风湿性关节炎（RA）局部炎症的关键因素，但其中具体的调节机制仍不明确。课题组前一个国基金项目发现T细胞自身特定的Notch受体分子参与胶原特异的Th17细胞分化，本项目旨在探讨关节局部增生的滑膜成纤维细胞（FLS）是否会通过提供外部Notch信号配体调节Th17细胞增殖分化。.研究内容主要包括三个方面：①分析RA 滑膜组织、体外培养的FLS及胶原诱导的关节炎小鼠（CIA）滑膜 Notch配体表达以及炎性因子对RA FLS Notch配体表达量/谱的影响；②体外实验探讨Notch配体融合蛋白等对Th17细胞体外扩增的影响；③体内实验研究干预CIA模型关节局部滑膜细胞Notch配体的表达对关节炎发生与发展的影响。.项目组首先建立了稳定的滑膜成纤维细胞的分离、培养方法以及小鼠Th17细胞体外诱导扩增的实验方法。体外实验研究结果发现，细胞因子刺激可诱导RA FLS表达特定的Notch配体或受体，同时也影响到FLS的功能如细胞因子、基质金属蛋白酶的分泌。RA患者FLS在IL-17的刺激下Notch 胞内段NICD表达水平明显增高，Notch配体D3亦明显升高，而D1变化不明显， J1则表达降低。D3融合蛋白可明显提高Th17细胞的诱导效率，D1融合蛋白的促进作用不明显。而Notch信号阻断剂DAPT可抑制Th17细胞的体外增殖、下调Th17细胞的绝对数及细胞因子IL-17水平。.通过建立CIA模型研究发现，免疫荧光法检测证实关节炎小鼠关节局部高表达Notch信号分子胞内段（NICD），提示局部组织细胞中Notch信号呈活化状态；此外，用免疫印迹法（WB）和免疫组化（IHC）分别证实CIA小鼠脾脏和淋巴结的CD4+ T细胞NICD的表达水平明显升高，与对照相比CIA小鼠滑膜组织也检测到NICD的高表达。体内实验也证实，在诱导关节炎的过程中使用Notch信号特异性的抑制剂:DAPT可显著减轻CIA小鼠关节炎症状。其机制在于通过抑制Th1和Th17细胞的增殖与分化。.以上结果证实Notch信号可介导关节炎相关的Th17细胞和滑膜成纤维细胞的相互作用，体内抑制Notch信号可阻止自身免疫性关节病情发生、发展，为发展基于干预Notch信号的免疫治疗提供了新的理论依据。