p53抑癌基因直接调控的miRNA靶基因的识别及电化学研究

This project is aimed at investigation and recognizaton of the target miRNA directly regulated by p53 tumor suppressor gene. First, screening new miRNAs that is capable of binding to p53 gene to regulate upstream transcription factor and downstream factor. Studing the predetermination method for the target miRNA based on particle swarm optimization(PSO) in combination with support vector machine (SVM). Constructing a integrated prediction model. Predicting new target miRNA by information fusion method. Establishing new electrochemical methods for the analysis of p53 regulatory target miRNA. Developing new methods for detecting the mutation of p53 gene at one or multiple mutation hot sites. Constructing new dynamic technique for real-time tracking the mutation of p53 gene. Investigating the relationship between the mutation of p53 gene and the expression level of target miRNA. Revealing the effect of other biomolecules (including drug molecules, etc.) on the miRNA expression in tumor cells. This research will help to further understand the molecular mechanism and the regulation role of p53 gene regulation network, and provide theoretical basis for the tumor prediction and diagnosis, as well as the drug design and screening.

本项目以p53抑癌基因直接调控的miRNA靶基因的识别及分析为研究目的。筛选新的具有p53结合位点且调控p53抑癌基因上游转录因子和下游基因的miRNA。研究miRNA靶基因预测方法，包括：建立基于粒子群算法（PSO）特征选择和支持向量机（SVM）联用技术等；构建整合预测模型，利用信息融合方法进行预测。建立p53抑癌基因调控的miRNA靶基因的电化学检测新方法，包括：建立p53抑癌基因突变检测新方法和多"突变热点"同时检测技术；发展实时跟踪p53抑癌基因突变的动态检测技术；研究miRNA的电化学检测方法;研究p53抑癌基因突变与miRNA靶基因表达水平的关系；研究其它活性分子（包括药物分子等）对肿瘤细胞的miRNA表达的影响。本课题研究将有助于更深入研究p53基因调控网络的分子机制与调控规律，为肿瘤的预测和诊断，以及药物设计和筛选提供理论依据。

本项目以p53基因直接调控miRNA靶基因的识别及其分析为研究目的。研究了miRNA错配能量图谱，建立了系列基于核酸恒温扩增技术的miRNA灵敏分析方法和细胞内miRNA的原位成像分析技术；发展了p53肿瘤抑制基因片段特异位点甲基化修饰灵敏电化学和荧光分析方法；研究了基因甲基化修饰动态检测电化学技术；探索了药物小分子对DNA甲基化酶（Dnmt3a）的影响。项目的研究取得以下几方面进展：（1）开发了基于三重循环放大反应串联的核酸扩增方法，非对称恒温指数扩增技术，以及基于环形锤状对称模板的恒温指数扩增技术，实现了组织、血液、单细胞miRNA表达的灵敏分析。（2）将化学氧化与核酸恒温指数扩增技术结合，建立了p53肿瘤抑制基因片段单特异位点甲基化检测新方法（COEXPAR）；通过设计多功能电化学分子信标，建立了方便快速的p53肿瘤抑制基因片段多特异位点甲基化修饰同时检测技术。（3）基于DNA长程电子传递特性并结合溴代衍生化增敏，发展了基因甲基化修饰过程连续检测电化学方法。（4）研究了小分子抑制剂对 Dnmt3a 酶活性的影响。研究成果发表SCI论文8篇，包括Nucleic Acids Res. 1篇，Anal. Chem. 2篇，TrAC-Trends in Anal. Chem. 1篇，Biosens. Bioelectron. 3篇，申请发明专利6件。本课题的研究实现了核酸恒温扩增方法在扩增效率、特异性和扩增偏差的同步提升，实现单细胞水平miRNA的准确分析；改善了当前基因甲基化修饰分析技术操作繁琐，成本高，耗时长等不足；提出了基因甲基化修饰动态检测技术。本项目在miRNA和基因甲基化相关疾病的研究方面具有理论意义和实用价值。