ABCG2甲基化分析及对瑞舒伐他汀代谢影响的机制性研究

DNA 甲基化是目前已知唯一天然DNA共价修饰方式，与基因表达调控密切相关。ABCG2基因编码乳腺癌抗性蛋白（BCRP），生物信息学和体外研究证实其启动子CpG岛甲基化程度与其表达负相关。通过制备志愿者粪便gDNA，利用甲基化敏感内切酶-实时定量PCR，重亚硫酸盐处理-测序和双荧光素酶活性检测等分析中国健康人群肠道上皮细胞ABCG2甲基化分布特征；阐明不同甲基化区段和甲基化位点对其表达的影响；将BCRP底物药瑞舒伐他汀（rosuvastatin）作为探针药，研究ABCG2甲基化对其药代动力学个体差异的影响。本项目将为遗传药理学研究的深入与拓展提供一种新的思路，为BCRP底物药在临床应用上个体化用药的实现提供新的研究基础；并以ABCG2为突破点，研究表观遗传学在药物反应个体差异中的作用；建立成熟研究体系，系统研究表观遗传学因素对现知可遗传性变异无法完全解释其个体差异的基因表达及功能的影响。

在基金资助下，利用焦磷酸测序仪器平台，本项目新建了焦磷酸测序检测ABCG2基因甲基化的技术方法。通过构建ABCG2基因甲基化和非甲基化质粒，通过配比获得一系列不同比例质控模板，再行PCR-焦磷酸测序对这一系列已知甲基化程度质控品进行甲基化程度检测并绘制回归曲线，结果证明该方法建立成功。利用该方法分析18株肿瘤细胞株ABCG2甲基化程度，部分细胞株检测结果与数据库或文献报道一致，证明本项目新建方法准确可靠。其余部分细胞株的ABCG2甲基化程度尚未见报道。本项目还利用该方法对收集到的24例健康中国男性粪便gDNA标本进行ABCG2甲基化检测，初步了解了中国健康男性肠道脱落上皮细胞中ABCG2甲基化分布特征，结果显示该基因1号外显子的甲基化程度在中国健康男性中存在显著差异，可能是影响该基因表达并进而导致个体药物反应差异的重要原因。为进一步了解ABCG2基因CpG岛不同区段的甲基化对该基因表达的影响作用，本项目构建了一系列包含不同甲基化与非甲基化区段的荧光素酶报告基因载体，通过瞬转细胞并检测荧光素酶活性，发现基础启动子和1号外显子的甲基化对于该基因表达具有显著影响。为了解和排除ABCG2具有功能意义的SNP对于后续研究的影响，本项目新建焦磷酸测序分析SLCO1B1基因521、388位，ABCG2基因34、421位多态基因型的方法，经多样本重复验证及毛细管电泳测序验证，确定所建新方法准确可靠，并对800例中国健康男性进行了分型分析，了解了上述SNP位点的分布特征。在分型分析结果的基础上，本项目对中国人群中常见的ABCG2 34位多态的功能意义进行了临床实验研究。同时，因为34和421位多态发生频率很高，且不在同一个block群中，因此该临床实验还探讨了不同34/421单倍型对于ABCG2底物药药代动力学的影响作用。本临床实验发现34位突变纯合子以及34位/421位双突变杂合子能够显著降低BCRP对底物药的转运，提高药物血药浓度。这一研究结果是首次发现，尚无文献报道。在本项目基金资助下，课题组成员还参与了其它一些研究工作。已发表SCI论文4篇，CSCD论文4篇，待发表SCI论文2篇，CSCD论文2篇。