耐高温马克思克鲁维酵母中一种新的抑制物耐受相关的转录因子的调控机制

Kluyveromyces marxianus is a thermo-tolerant yeast which can grow at temperature higher than 42℃ and keeps relatively high ethanol fermentation efficiency. Fermentation at elevated temperature has some advantages such as reduced cool cost and contamination in large scale fermentation. We have constructed a strain which can assimilate glucose and xylose simultaneously to produce ethanol, pyruvate, xylitol, but the inhibitors produced during the pretreatment of lignocellulosic biomass reduced the fermentation efficiency. Current researches of inhibitor tolerance mainly focus on directly related enzymes and proteins. The reports of inhibitor-specific transcriptional regulator are seldom. We found a potential transcriptional factor FRR through the RNA-seq of K. marxianus with or without inhibitor. Disruption of the gene of this protein led decreased inhibitor tolerance, and overexpression of FRR could imporve the inhibitor tolerance. In this application, we will use ChIP-seq, EMSA, RNA-seq and reporter system to screen and identify the DNA binding sites and target genes of this protein; use gene disruption and overexpression to figure out the function of target genes; analyze the protein and the target genes function in inhibitor (mainly furfural and HMF) tolerance; summary the interaction of the FRR and those genes encoded proteins. The results of this research will provide important information for higher inhibitor tolerant strain construction in biochemical production with lignocellulosic biomass.

马克思克鲁维酵母有高温下快速生长，在工业发酵中降低能耗减少污染等优势。我们在该酵母中实现了共利用葡萄糖和木糖生产乙醇、丙酮酸及木糖醇等生物基化学品，但木质纤维素生物质预处理产生的抑制物会降低该酵母的发酵效率。目前对酵母抑制物的耐受以直接相关的蛋白的研究为主，与抑制物耐受特有的转录调控因子的研究很少。我们通过该酵母在抑制物存在与否时的转录组分析发现一种与抑制物尤其是糠醛类的耐受有关的转录因子（FRR），并证实该基因的敲除或过表达可以降低或提高此酵母对抑制物的耐受。本项目将以此转录因子为研究对象，以其对糠醛类耐受作用为重点，拟采用ChIP-Seq、RNA-seq、EMSA及报告基因分析等技术，运用基因敲除及过表达等基因工程技术手段确定FRR调控的目标基因，并对调控的基因在抑制物耐受中的功能进行鉴定，解析FRR作为关键节点的糠醛类耐受机理，为提高该酵母对抑制物的耐受提供工程改造的重要信息。

木质纤维素类生物质具有可再生、储量大、价格低廉等特点成为重要的生物资源。马克斯克鲁维酵母有高温下快速生长、在工业发酵中降低能耗减少污染等优势，但木质纤维素生物质预处理产生的抑制物会降低该酵母的发酵效率。首先，本课题发现马克斯克鲁维酵母中一个功能未知可能是转录因子的基因（KmFRR）的敲除或过表达可以降低或提高该酵母的抑制物耐受。该基因编码的蛋白截短至前100个氨基酸才能够获得稳定的蛋白，且该区域包含一个类GAL4的DNA结合区，并定位到细胞核。我们将截短的蛋白表达后进行了CHIP-seq分析，获得了13个Peak，包含9个潜在的目标蛋白基因。其次，我们还通过转录组发现了另外三个影响酵母抑制物耐受的基因。第一个是定位到线粒体的硫酯酶基因（KmYME），虽然过表达该基因并不能提高酵母抑制物耐受性，但是敲除该基因显著降低马克斯克鲁维酵母对抑制物的耐受性，且该蛋白的酶活性是抑制物耐受必须的。还发现敲除该基因会导致胞内辅酶合成、ATP合成的下降，ROS的积累增加，CoASH浓度上升。综合考虑，可能敲除KmYME导致了CoASH池的不平衡而使抑制物耐受性下降。第二个为前折叠素亚基4（KmPFD4）的基因，敲除或过表达该基因会使马克思克鲁维酵母对抑制物的耐受下降或上升，该蛋白主要定位到细胞核，敲除该基因的菌株的转录组分析显示KmPFD4被敲除后，酵母细胞对抑制物刺激带来的大量的基因表达变化消失了，结合前折叠素的已知功能可以推测KmPFD4通过提高细胞骨架的稳定性和调控抑制物耐受相关的基因表达来影响酵母的抑制物耐受性。第三个基因为硝基还原酶的基因KmHBN1，敲除或表达该基因会导致马克斯克鲁维酵母对抑制物耐受的降低或提高。KmHBN1的敲除会导致消除ROS的相关基因的表达下降而使酵母抑制物耐受下降。KmHBN1虽然具有硝基还原酶活性，但是并不能降解常见的纤维素生物质衍生的抑制物，因此KmHBN1通过间接的影响酵母中抑制物耐受相关基因而影响酵母的抑制物耐受性。最后，在获得上述信息的基础上，我们通过过表达KmFRR或KmHBN1构建了抑制物耐受提高的菌株，在玉米芯的同步糖化和共发酵中，构建的菌株的乙醇生产效率显著提高