一种耐高温非常规酵母的葡萄糖对木糖利用抑制的关键节点的机制研究

Fermentation at elevated temperature has lots of advantages in bioconversion, and co-fermenation of glucose and xylose is very important to economically industrial procedure. Kluyveromyces marxianus can grow fast and ferment very well at elevated temperature (≥42℃). Though the engineered K. marxianus could use glucose and xylose simultaneously, the xylose assimilation ability can be repressed by glucose and thereafter, the yield of products decreased. In this study, the key proteins in the repression procedure will be clarified through hexose transporters and glucose sensing system. Firstly, the main hexose transporters will be cloned and recombinantly expressed in null hexose transporter yeast strain, and the kinetic properties of xylose and glucose transportation will be investigated to determine the function of each transporter in K. marxianus. A balanced hexose transporter combination which can transport glucose and xylose simultaneously will be constructed. Secondly, the genes of key proteins in glucose senesing and repression system will be determined through gene disruption, and genetic modification will be conducted to reduce or eliminate the glucose repression in K. marxianus. Finally, the glucose repression elimination and balanced hexose transporter system are combined to construct a thermo-tolerant glucose and xylose simultaneously assimilating yeast platform. It should be a very useful foundation for high-efficient lignocellulosic biomass assimilating and chemical producing thermo-tolerant yeast construction.

高温发酵在生产中有很多优势，而葡萄糖与木糖共发酵是提高木质纤维素乙醇生产效益的基础。马克思克鲁维酵母具有在高温(≥42℃)下快速生长和较好的发酵能力，并且天然能利用木糖。目前该酵母已实现对葡萄糖/木糖的共发酵，但葡萄糖对木糖利用抑制的现象极大影响了糖醇转化率。本项目拟从糖转运和葡萄糖感应系统两个关键节点探寻引起葡萄糖抑制的关键蛋白。①在无己糖转运蛋白的酵母菌株中，评价内源性主要己糖转运蛋白的糖转运能力，分析葡萄糖对木糖转运抑制的动力学特性，结合己糖转运蛋白基因选择性敲除和木糖特异性糖转运蛋白基因重组表达以构建葡萄糖和木糖均衡转运的糖转运体系；②通过基因的预测和敲除确定感应葡萄糖并抑制木糖利用的关键蛋白，通过基因工程改造减弱葡萄糖抑制效应；③结合构建的糖转运体系，构建高温下能同时高效利用葡萄糖和木糖的马克思克鲁维酵母平台菌株，为构建高效利用木质纤维素生物质生产化学品的耐高温酵母菌株奠定基础。

木质纤维素素生物质水解后最主要的两种可用于发酵的单糖是葡萄糖和木糖，充分利用这两种糖是提高利用木质纤维素生物质生产化学品的经济性的前提之一。但是很多微生物利用木糖能力差，而葡萄糖对木糖利用的抑制会进一步降低利用木糖的效率，最终导致微生物利用木质纤维素的效率较低。马克思克鲁维酵母能在较高温度下利用木糖，是很好的利用木质纤维素生物质的平台菌株，但是由于葡萄糖抑制效应影响了对木质纤维素生物质的充分利用。本课题从木糖和葡萄糖的转运蛋白、受葡萄糖调控的关键木糖代谢基因、葡萄糖抑制效应的信号通路三方面对马克斯克鲁维酵母中葡萄糖对木糖的抑制效应进行了研究。首先，对基因组中预测的20个单糖转运蛋白基因在构建了木糖利用途径的无单糖转运蛋白的酿酒酵母中进行表达，发现有8个转运蛋白能够转运葡萄糖，而其中2个还能转运木糖；在生产木糖醇的工程菌株中通过表达多拷贝的木糖特异的转运蛋白突变体GAL2N365F，实现共利用葡萄糖和木糖生产木糖醇。其次，鉴定了马克斯克鲁维酵母中的己糖激酶基因（KmHXK)和葡萄糖激酶（KmGLK）基因，并确定己糖激酶基因的敲除可以使葡萄糖抑制效应解除，而葡萄糖激酶基因的敲除不会解除葡萄糖抑制效应；发现KmMIG1基因的敲除可以解除葡萄糖对蔗糖、半乳糖、棉籽糖等碳源利用的抑制，却无法解除葡萄糖对木糖利用的抑制，提示这可能存在新的葡萄糖抑制信号路径；进一步敲除KmMIG1上游的SNF1基因显示该基因的敲除会导致在没有葡萄糖时，包括木糖在内的非葡萄糖碳源的利用会被抑制；另外SNF3基因的敲除也可以使葡萄糖抑制效应解除， 证明马克斯克鲁维酵母中SNF3路径不仅仅只是调控转运蛋白的表达；再次，通过转录组和定量PCR结果证实，木糖代谢的三个关键酶的基因的表达都可以被木糖诱导，但是只有木糖醇脱氢酶基因的表达是被葡萄糖抑制的，也就是受葡萄糖抑制效应严谨调控；最后，在己糖激酶基因敲除菌株的基础上构建了木糖和葡萄糖共利用的平台菌株，结合木糖特异的转运蛋白，实现了共利用木糖和葡萄糖高效生产木糖醇和丙酮酸、利用玉米芯高效生产L-乳酸。