马克斯克鲁维酵母GX-UN120木糖跨膜运输机制的研究

The efficient conversion of xylose plays an important role in the economic bioconversion of lignocellulose to biofuels. Xylose transport across the cell membrane is the first rate-limiting step of xylose utilization. However, there is little scientific paper on the xylose transport across the cell membrane. Kluyveromyces marxianus can ferment glucose and xylose to produce ethanol at temperatures above 40℃.But the xylose consumption of K. marxianus is low and the utilization of xylose is inhibited by glucose. To resolve this problem, it is necessary to improve the efficiency of xylose transmembrane transport. This project will study the function of 28 sugar transporters by cloning the sequences of the 28 genes from the genomic DNA of K. marxianus GX-UN120 with the primers designed according to the complete genome sequence of K. marxianus DMKU301042 and introducing the 28 genes, respectively, into the Saccharomyces cerevisae EBY.VW4000 in which almost all the hexose transporter genes are deleted. The objective of this project is to obtain 1 or 2 sugar transporters which can specifically transport xylose into the cell of K. marxianus GX-UN120.The transmembrane transport mechanism of the xylose-specific transporters are investigated.

木糖的有效利用对于纤维素质生物转化具有重要作用，而木糖的跨膜运输是木糖利用的第一个限速步骤。然而，在过去的研究中人们对于木糖的跨膜运输的研究报道较少。马克斯克鲁维酵母能在高温下发酵葡萄糖和木糖产乙醇，有望成为继酿酒酵母之后的另一个重要的乙醇生产菌种。但是，马克斯克鲁维酵母对木糖的利用率低、且受葡萄糖的抑制。要想解决这个问题，首先要解决马克斯克鲁维酵母木糖的跨膜运输问题。本项目拟利用DMKU3-1042菌株的基因注释和转录组分析结果设计引物从GX-UN120菌株上扩增尚未被研究的28个糖转运蛋白基因，分别转入EBY.VW4000菌株中，研究这28个糖转运蛋白的功能，确定能够转运木糖的糖转运蛋白，并从中找到1~2个对木糖的转运效率高、不受葡萄糖抑制的木糖特异性转运蛋白，研究其木糖跨膜运输机制，为实现马克斯克鲁维酵母同步利用葡萄糖和木糖发酵生产乙醇提供理论基础。

经课题组成员的共同努力，我们成功地在马克斯克鲁维酵母GX-UN120菌株上扩增到28个糖转运蛋白基因，分别转入EBY.VW4000菌株中。目前已经研究了26个糖转运蛋白对葡萄糖（Glu）, 果糖（Fru）,甘露糖（Man）, 半乳糖（Gal）, 山梨糖（Sorb）, 木糖（Xyl），阿拉伯糖（Ara）, 核糖（Rib），蔗糖（Suc），乳糖（Lac）的转运功能。通过对已研究的26个糖转运蛋白基因的糖转运功能发现有21个糖转运蛋白可以转运木糖，其中木糖转运能力比较好的是Km_SUT1和Km_SUT2这两个糖转运蛋白。虽然在马克斯克鲁维酵母GX-UN120菌株中没有找到木糖特异性转运蛋白，但我们也正在尝试采用理性设计和定向进化的方法对Km_SUT1、 Km_SUT2和Km_SUT5这三个转运蛋白基因进行分子改造，以期获得木糖转运效率高、解除葡萄糖抑制的木糖特异性糖转运蛋白基因。另外，我们还在马克斯克鲁维酵母GX-UN120菌株中分别缺失14个糖转运蛋白基因，并通过比较糖转运蛋白基因缺失菌株与原始菌株对各种糖的利用能力的差异，研究了糖转运蛋白基因的缺失对GX-UN120菌株利用各种糖的能力的影响。