利用单分子技术解析酿酒酵母复制体应答DNA损伤的分子机制

The complicated and sophisticated replisome installed at replication fork is the elementary unit of DNA replication in eukaryotes, and the assembly of replisome is tightly regulated by the cell cycle. The integrity and stability of replisome is critical for efficient DNA replication. However, DNA damage on the replication template in S phase is likely to trigger fork stalling or replisome collapse, causing chromosome rearrangement and genome instability. Therefore, one of the most important open questions in the field of DNA replication is how the replisome responds to damaged DNA on the replication template. In this grant proposal, using the budding yeast nuclear extracts which support the DNA replication under physiological condition, we will directly image the dynamic process of replisome collision to damaged DNA on replication template in real-time by single-molecule methodologies. The proposed research will explore how the replisome responses to different DNA damage during the collision, the contribution of accessory proteins to replisome integrity, and the function of replication checkpoint on replisome stability. This study will facilitate us to elucidate the molecular mechanisms underlying the stress response of eukaryotic replisome to DNA damage and the complex regulatory system to coordinate DNA replication and DNA damage repair. This knowledge has a significant impact on the fields of DNA replication and DNA damage repair.

组装在复制叉上的复杂而精密的复制体是真核生物进行DNA复制的基本单元，其装配过程受到细胞周期的严格调控。复制体的完整性和稳定性对于保证DNA 复制的高效进行至关重要。然而，S期存在于复制模板上的DNA损伤可能引起复制叉停滞或复制体解体，从而导致染色体重排和基因组不稳定。因此复制体在复制行进过程中如何应答模板上的各种DNA损伤障碍，一直是DNA复制领域亟待解答的难题。本研究拟利用酿酒酵母制备可以完全模拟生理条件下DNA复制的体外复制体系，结合单分子成像技术，对复制模板上DNA损伤对复制体的阻挡过程进行实时、动态地直接观测，以期回答复制体对不同DNA损伤障碍的应答、复制体中的辅助蛋白对于复制体完整性的贡献以及复制检验点在维持复制体稳定性中的作用。本研究可以帮助我们解析真核生物中DNA复制体应答DNA损伤的分子机制，理解DNA复制与DNA损伤修复之间的复杂调控体系，具有极其重大的理论意义。

DNA复制是生物传递遗传信息的关键步骤，依赖于多种蛋白之间、以及蛋白与DNA之间复杂的、受到严格调控的动态相互作用。传统集合平均的生化方法难以捕获这些相互作用中的随机过程和瞬时中间态，而新兴的单分子技术则能对其进行实时动态观测，因此非常适于DNA复制研究。本项目针对DNA复制中的基本科学问题，利用单分子全内反射荧光成像技术研究了复制起始蛋白、复制体、染色质蛋白等复制相关蛋白与DNA之间的动态相互作用，从单分子水平解析DNA复制的分子机制。本项目的主要成果如下：（1）成功建立了可模拟生理条件下真核生物体外DNA复制的生化体系YNPE，与酿酒酵母便捷的遗传操作相结合，成为研究真核生物DNA复制的有力工具；（2）建立并优化了适于DNA复制研究的单分子实验方法；（3）在单分子水平观察到酵母的ORC蛋白复合体在早期复制起点比晚期复制起点有更高的结合几率，为解释真核生物DNA 复制起始的时空调控机制提供了证据；（4）发现染色质蛋白Cren7、Sso7d体外包装λ DNA的单分子动力学行为总体上较为相似，但是Cren7的包装效率高得多，另外计算得到的压缩反应平衡常数接近各自结合dsDNA的表观解离常数，提示DNA包装与DNA结合是偶联的；（5）利用单分子FRET方法研究了Cren7蛋白促进DNA成环/包装的机制，实验结果提示Cren7可能结合到DNA上使之弯曲或缩短，还可能参与稳定DNA的粘末端配对；（6）发现染色质蛋白mIHF体外包装λ DNA的单分子动力学曲线表现为明显的3个阶段，提示mIHF蛋白对DNA的包装涉及多种不同的分子机制。