删除CD4+CD25+Treg协同A549-RNA-DC疫苗诱导抗肿瘤免疫应答作用的研究

基本信息
批准号:81172172
项目类别:面上项目
资助金额:60.00
负责人:王保龙
学科分类:
依托单位:安徽医科大学
批准年份:2011
结题年份:2015
起止时间:2012-01-01 - 2015-12-31
项目状态: 已结题
项目参与者:何义富,胡冰,完晓菊,蔡娟,金娟,蔡秋妍,魏静,韩琴
关键词:
非小细胞肺癌CD4+CD25+Treg肿瘤疫苗
结项摘要

在前期研究工作中,我们用人肺腺癌细胞株A549总RNA转染DCs构建了A549-RNA-DCs疫苗,体外试验证明其具有诱导肿瘤抗原特异性免疫反应的作用,且效应CTL有很强的杀伤肺腺癌细胞的功能。为了开发具有临床应用价值的肿瘤疫苗,本项目拟开展以下研究:1. 针对目前广泛应用的DC成熟诱导剂中含对DC成熟有抑制作用的PGE2和缺少Toll样受体信号刺激的缺陷,优化DC成熟诱导条件,诱导产生表型和功能成熟的DC(EDCs),以增强疫苗的免疫原性。2.构建A549-RNA-EDCs疫苗,通过体外试验和体内试验,研究其诱导肿瘤抗原特异性免疫应答的能力。3.针对CD4+CD25+Treg在肿瘤免疫耐受中的关键作用, 应用Ontak(美国FDA批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤的抗肿瘤药物)删除CD4+CD25+Treg,探讨A549-RNA-EDCs疫苗和Ontak联合治疗非小细胞肺癌的可行性。

项目摘要

在DC疫苗的研制中,目前广泛采用传统的“金标准”细胞因子鸡尾酒( TNF-α、IL-6、IL-1β 和 PGE2)诱导DCs成熟。然而,该方法因含有PGE2和缺少TLR信号刺激,不利于DCs合成IL-12。因此,其有效性具有争议。本项目对“金标准”细胞因子鸡尾酒进行改良,在诱导体系中加入TLRs 配基 polyI:C和CpG ODN来优化诱导DCs成熟条件,有效地增强了DC疫苗的抗肿瘤效应。主要内容和结果如下。1.用电穿孔法转染A549总RNA至未成熟DCs制备DC疫苗,分别用“金标准”鸡尾酒和改良鸡尾酒(IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、polyI:C、CpG ODN)体外诱导DCs成熟。采用FACS、QRT-PCR和WB等方法测定相关分子表达,ELISA测定IL-12p70和IL-10的分泌。结果:改良组DCs表面高表达CD80、CD83、CD86、CXCR4、CCR7、CCL19、CCL21和 CXCL21;CCR5表达显著下调;CXCR4、CCL19、CCL21和CXCL21表达显著上调(P<0.05);IL-12p70分泌明显增高(P<0.05)。2.分别用“金标准”鸡尾酒和改良鸡尾酒诱导转染过A549总RNA的DCs成熟,并与自体T细胞混合培养,诱导产生抗原特异性的CTL。采用MTT法测定细胞增殖指数,FACS鉴定T细胞表型,ELISA测定培养上清液IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5和IL-10的含量。结果:改良组T细胞增值指数、CD3+CD8+ T细胞比例和IFN-γ、TNF-α含量显著增高(P<0.05)。3.建立A549荷瘤裸鼠模型,尾静脉注射CM-DiI标记的DCs,取肝脏、脾脏和瘤体制片,荧光显微镜观察DC的迁移。以改良组肝脏、脾脏和瘤体组织中的红色荧光标记细胞最多。4.采用多点注射法,将CTL注入瘤周。测量肿瘤体积,末次免疫7 d后,处死荷瘤裸鼠,称取瘤重,计算抑制率。免疫组化法和WB检测肿瘤组织COX-2、VEGF、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。结果:改良组CTL抑瘤率最大(69.62%)、Bax表达上调;COX-2、VEGF和Bcl-2表达下调。上述结果提示,改良鸡尾酒能诱导产生高成熟度的、具有较强迁移能力和抗肿瘤作用的DCs。

项目成果
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数据更新时间:2023-05-31

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