p66shc对绵羊卵母细胞体外成熟过程中线粒体功能调节的研究

The quality of mammalian oocyte matured in vitro was still poor,which was mainly the result of dysfunctional mitochondria. Mitochondria are most important organelles in oocyte,contributing to ATP production as will as reactive oxygen species that is detrimental to oocyte.P66shc is a key gene affecting the function of mitochondria,which has studied widely at present. In this project, p66shc expression,mitochondrial activity and redox state in sheep oocyte during in vitro maturation were investigated, and their interaction were analyzed.moreover we will selectively diminish p66Shc gene expression in sheep oocytes by RNA-mediated interference,and to determine the effect of p66shc on mitochondrial activity and redox state in sheep oocyte during in vitro maturation. Objective of this project is to provide a key information for elucidating regulation mechanism of mitochondrial function in oocyte, and help to improve culture condition for oocyte matured in vitro.

目前哺乳动物卵母细胞的体外成熟质量仍然很低，这很大程度上是由于线粒体功能失调所致。线粒体是卵母细胞中一个重要的细胞器，它在合成ATP的同时也产生有害的活性氧，p66shc对线粒体功能的调节起着关键作用，也是目前生命科学领域研究的热点之一。本项目拟对绵羊卵母细胞成熟过程中的p66shc表达水平，线粒体活性和氧化还原状态的变化进行检测，分析它们之间的相关性。同时利用RNA干扰技术对绵羊卵母细胞中P66shc的表达进行干扰，从而确定p66shc对绵羊卵母细胞中线粒体活性和氧化还原状态的影响模式。本项目的实施为揭示卵母细胞中线粒体功能的调节机制提供重要信息，从而为提高卵母细胞体外成熟体系提供理论依据。

哺乳动物胚胎体外生产效率低，很大程度上与卵母细胞体外成熟质量差有关。本研究旨在探讨采用C型利钠肽暂时抑制绵羊卵母细胞核减数分裂进程延长胞质成熟时间，促进核质同步成熟，以期提高卵母细胞体外成熟质量及其后受精后胚胎的发育能力，同时研究了氧化应激蛋白p66Shc在绵羊卵母细胞成熟过程中的表达特征以及对胞质氧化还原稳态调控，为阐明p66Shc调节卵母细胞线粒体功能的分子机制，提高绵羊体外胚胎生产效率提供理论依据。主要研究结果如下：.1. 利用C型利钠肽构建绵羊卵母细胞体外“双阶段”成熟培养体系。200 nM/L CNP能够在4 h之内有效维持绵羊COCs的减数分裂停滞。与常规体外24 h IVM，用200 nM/L CNP预孵育COCs 4 h，然后体外成熟24 h的囊胚率和囊胚质量显著（P<0.05）优于其他组实验组。200 nM/L CNP预孵育4 h然后体外成熟24 h的卵母细胞线粒体分布与常规24 h成熟卵母细胞的线粒体分布相似，线粒体主要集中于卵母细胞的皮质区域，但具有较大线粒体簇。同时CNP预处理可上调未成熟卵母细胞外周卵丘颗粒细胞中扩展基因HAS2、PTGS2、PTX3及成熟后卵母细胞中母源基因Dnmt1、Zar1、Mater的表达，这些结果表明，CNP预孵育绵羊COCs提高了卵母细胞的成熟质量和发育能力，并且具有促进体外胚胎生产效率的巨大潜力。.2. p66Shc在绵羊卵母细胞中的表达及其与胞质氧化还原稳态的关系。成熟前劣质和成熟后老化卵母细胞中p66Shc mRNA和蛋白的表达分别显著高于成熟前优质和常规24 h成熟的卵母细胞（P<0.05）；与成熟前优质和常规24 h成熟的卵母细胞相比，成熟前劣质和成熟后老化卵母细胞表现出线粒体分布紊乱和活性下降、ROS水平升高以及氧化还原稳态的失衡；RNA干扰 P66Shc基因降低绵羊卵母细胞活性氧的产生。此外，外源H2O2诱导的氧化应激显著上调 p66Shc蛋白的表达并促使 p66Shc由胞质向细胞核定位。综上表明，p66Shc通过影响线粒体功能而进一步影响了绵羊卵母细胞胞质氧化还原稳态。