绵羊胚胎细胞凋亡机制的研究

胚胎细胞凋亡的研究已成为生命科学领域的热点之一。本项目系统研究了绵羊不同来源胚胎（体内胚胎、体外受精胚胎，孤雌激活胚胎和体细胞核移植胚胎）的细胞凋亡起始时间、凋亡发生频率、囊胚内细胞团和滋养层的细胞凋亡频率以及胚胎细胞中线粒体的状态。同时研究了凋亡相关基因（Bax、Bak、Bad、Bik、Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W 、caspase-3和caspase-9）在各阶段胚胎中的表达情况和不同培养环境对绵羊胚胎体外发育过程中凋亡的影响。了解绵羊胚胎细胞发生凋亡的规律，最终阐明控制其凋亡发生的分子机制，提高绵羊胚胎体外发育能力。

本项目系统研究了绵羊胚胎的细胞凋亡起始时间、凋亡发生频率、凋亡相关基因在各阶段胚胎中的表达情况以及培养环境对绵羊胚胎细胞凋亡的影响，同时研究了细胞中线粒体的状态。. 实验结果表明，在培养液中添加CYS和EGF可以提高绵羊卵母细胞和体外受精胚胎发育的发育能力，并降低胚胎凋亡发生率。相对于受精胚胎（体外或体内），孤雌激活的胚胎出现凋亡信号的时间较早，大多发生于8细胞阶段。但在低氧环境（5%O2）和高氧环境（20%O2）下发育的绵羊体外受精胚胎，细胞凋亡信号都起始于16细胞期，且在胚胎各发育阶段发生凋亡的比率没有明显差异。低氧环境的囊胚发育率和囊胚细胞数都显著高于高氧环境的，且其囊胚细胞的凋亡指数也显著低于高氧环境组。. 不论是高氧环境还是低氧环境，在绵羊体外受精胚胎的各阶段都能检测到Bax和Bcl-2的表达，而且在囊胚阶段，低氧环境下的Bcl-2基因表达量明显高于高氧环境下的。在高氧环境和低氧环境下，从2-细胞阶段到囊胚均可检测到Mcl-1、Bad、Bak、Bik和Caspase-3的表达，Caspase-3基因表达水平随着胚胎的发育有逐渐增高的趋势，且高氧和低氧间差异不显著；从8-16细胞期开始，Mcl-1、Bad、Bak和Bik表达水平都显著增加，且低氧环境中的表达水平均明显低于高氧环境的表达水平。. 绵羊卵母细胞经CNP预处理8h，再进行成熟培养26h的成熟效果明显提高，其受精后的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数都明显高于常规成熟组的。卵母细胞成熟过程中线粒体的分布规律为：由未成熟时的周边分布逐渐变为成熟时的均匀分布，而CNP预处理8h的卵母细胞中线粒体线粒体多呈半周边分布，但在随后的成熟培养中也逐渐变为均匀分布。CNP预处理8h，再进行成熟培养26h后的卵母细胞中的线粒体拷贝数明显提高。