细菌砷氧化驱动的砷脂形成和代谢途径的变化

Bacterial arsenite oxidation transforms the more toxic As(III) compounds to the less toxic As(V). Arsenic is a chemical analog of phosphate and arseno-lipids have been found in some higher organisms. In prokaryotes, recently, we found arsenate in polar lipids in the As(III)-oxidizing Agrobacterium tumefaciens GW4 (Wang et al., EM, 2015; supported by the finished NSFC project), but the molecular types and the synthesis pathways of the arseno-lipids are still needed to determine. We also observed significant changes of some lipid and energy metabolic pathways using proteomics analysis which indicates that under phosphate-limited condition, the produced As(V) could substitute for phosphate with biological functions. In this project, the polar lipids will be isolated and separated by TLC, and later, the molecules of the arseno-lipids will be identified using HPLC-ICP-MS in combination with LC-MS. In addition, the transcription analysis of some key genes related to the As(V) substitution of phosphate will be studied based on the preliminary proteomics data and gene knock out and complementation will also be performed. In combination with the detection of ATP、NADH，some important metabolic products and the analyses of the transcription and proteomics data, the alternation of the synthesis of lipid pathways will be established. Determination of the molecules and lipid metabolic pathways of bacterial arseno-lipids is a challenging project with very significant and scientific values.

细菌砷氧化是将毒性强的三价砷As(III)氧化为毒性弱的五价砷As(V)的过程。砷是磷的类似物，至今在一些高等生物中有砷脂的报道，在原核生物中，我们近期在砷氧化型根癌农杆菌GW4中首次发现了含砷极性脂 (Wang et al., EM, 2015；已结题基金)，但其砷脂的类型及合成途径还需深入解析。蛋白质组学也显示砷氧化对脂代谢和能量流的改变显著，预示砷在缺磷的条件下代替了磷而行使功能。本课题将在此基础上，利用薄层层析(TLC)分离GW4菌的含砷极性脂，结合HPLC电感耦合等离子质谱(HPLC-ICP-MS)和液相色谱质谱(LC-MS)等分析确定砷脂的类型。同时，我们将进行重要基因的转录分析、敲除与互补，结合关键代谢产物和ATP、NADH含量检测等，确定砷氧化对脂代谢通路的影响。基于这些基因功能、代谢物、转录和蛋白组等综合分析，阐明细菌砷脂类型和其合成途径，具有重要创新性科学价值。

砷是磷的类似物，至今在一些高等生物中有砷脂的报道，在原核生物中还没有阐明其砷脂类型。本课题的主要目标是阐明细菌砷氧化驱动的砷脂形成和代谢途径的变化。根癌农杆菌GW4是一株砷氧化细菌，并在低磷条件下加砷促长，且砷酸盐As(V)可能掺入到脂质中形成砷脂。为了阐明其脂代谢机制及细菌砷脂结构，本研究以菌株GW4为模式菌，研究了其砷氧化对细菌代谢路径的影响、砷磷共调控机制及含As(V)条件下的总代谢物和极性脂的变化，预测了其菌株内可能存在的砷脂类型。结果如下：(1)确定了细菌砷氧化调控蛋白AioR也调控磷酸等代谢途径；(2)发现磷酸盐转运调控蛋白PhoB1和PhoB2分别在低磷含As(III)和低磷无As(III)条件下发挥调控功能，提出了细菌砷磷代谢的严谨调控机制；(3)总代谢组和脂代谢组分析发现很多代谢物加As(V)都上调。a.细胞内抗氧化性和DNA修复相关的代谢物，如脯氨酸、谷氨酸、色氨酸、甜菜碱、黄嘌呤、次黄嘌呤、烟酰胺以及亚牛磺酸等物质会增多，从而减轻As(V)对细胞的损伤并修复受As(V)影响的DNA; b.代谢路径和荧光定量PCR分析表明，As(V)能够提高TCA循环的活性，而且能量产生相关的代谢物也会增多，从而产生更多的能量物质，与As(V)促进GW4生长的现象相符; c.脂代谢组结果显示，菌株GW4的脂质组成主要包括三种甘油酯GL(糖基甘油二酯MGDG、甘油二酯DGDG和三酰甘油TG)，甘油磷脂(磷脂酰胆碱PC、磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰甘油PG、磷脂酰丝氨酸PS、磷脂酸PA)和微量溶血脂类(lysoPE和lysoPC)。其中磷脂酰胆碱是首次在细菌中发现的与真核生物的脂质类似的脂质，其可能与As(V)抗性相关。总的来说，在As(V)胁迫下，所有的甘油酯表达量都增加，在甘油磷脂中，PE、PA减少，而PG的含量增加。通过分析这些含砷极性脂，我们预测了细菌砷脂的类型和其结构，认为砷脂取代了磷脂，达到了细菌在低磷环境高效利用磷的目的。本项目的研究成果对于理解微生物砷磷相关代谢及细菌砷脂的作用具有重要意义。