亚砷酸氧化菌对砷的感应和信号转导机制研究

亚砷酸氧化菌氧化毒性强的As(Ⅲ)至毒性弱As(V)，有利于环境的砷解毒,但该类菌和砷的互作机制目前还知之甚少。我们前期的研究预示了亚砷酸氧化酶活性的调控不单是典型的原核生物抑制/激活蛋白模式，而可能是全细胞组分的砷感应和信号转导途径。本课题以我们分离的一株新型亚砷酸氧化菌为材料, 对细菌砷氧化过程中细胞周质的信号感应和跨膜信号转导机制进行研究，以确定感应蛋白的膜定位、功能域、结合蛋白功能，群体感应信号转导等机制。其结果将使我们深入了解细菌和环境(类)金属离子的感应和应答，并预期建立新型的细菌砷感应调控模式。该课题在细菌基因表达和调控研究领域有较大理论价值。阐明细菌与环境砷的互作机理将为环境砷污染的起因和生物修复提供理论依据。

本课题主要对亚砷酸盐氧化菌砷氧化过程的跨膜信号转导机制进行了研究，对两株亚砷酸盐氧化菌Achromobacter arsenitoxydans SY8 和Pseudomonas stutzeri TS44的基因组分析发现,他们分别具有含砷氧化酶基因簇在内的砷基因组岛，这两株菌特殊的砷基因组岛在其各自同属的已测序的几个细菌基因组中均没有发现。预测这两个砷基因岛极有可能通过近期的水平基因转移获得。. 我们发现SY8菌中砷氧化双组份调控蛋白AioSR前面有一个未知功能蛋白AioX，与磷酸盐结合蛋白同源性很高。为了检测这个蛋白是否也与砷氧化的调控相关，我们利用基因敲除、互补和氧化、生长表型等分析，发现aioX基因敲除突变株没有完全丧失砷氧化能力，但是砷氧化起始时间明显滞后了40个小时。aioX互补株的砷氧化能力和时间恢复了到了野生株的水平。因此确定aioX基因参与了砷氧化酶的表达调控。结合在另一株砷氧化菌5A中的结果，我们认为AioX起结合砷的作用。为了研究其信号传递机制，我们利用酵母双杂交技术证实了SY8菌的AioX和感应蛋白AioS的周质部分有相互作用，而调控AioR 和AioS蛋白的胞质部分存在相互作用。这个实验证明AioS需要周质结合蛋白AioX的介导来感应As(Ⅲ)。. 我们发现在SY8菌和另一株亚砷酸盐氧化菌NO1中的砷氧化酶基因aioAB启动子前面均存在16bp的保守回文序列，该回文结构的模体特征与σ54依赖型启动子的上游激活序列极为相似。所以我们推测在aioAB启动子上游的回文结构模体是上游激活序列，通过与AioR结合参与aioAB表达调控。利用细菌单实验杂交，我们在NO1中证明了AioR与回文序列存在相互作用。. 通过以上一系列实验，我们基本证明了亚砷酸盐氧化菌的砷感应和信号转导机制：即周质亚砷酸盐结合蛋白AioX捕获胞外As（Ⅲ）信号，并将信号传递给跨膜组氨酸激酶AioS，导致AioS构象改变，自身磷酸化；通过磷酸基团转移给胞质的反应调控子AioR，结果AioR构象发生改变被激活，从而与rpoN编码的δ-54因子发生互作，最终启动砷氧化结构基因aioAB的转录表达。. 研究过程中我们还发现环境的砷、磷浓度对细菌砷抗性种群的变化有显著影响，砷氧化菌还具有促进植物富集砷的效果，并发现和鉴定了一株砷抗性菌新种。