钩状木霉与枯草芽孢杆菌对核桃炭疽病的协同生防作用机制研究

Trichoderma hamatum YB-4-15 and Bacillus subtilis yb33 has good inhibitory effect against walnut anthracnose, to clear the field biocontrol effect and colonization for these antagonistic microorganisms against walnut anthracnose through field trials, and to resolve the microbial communities through Biolog and PCR-DGGE technique, and to clear the influence on the surrounding microorganisms and the growth-promoting effect of walnut, meanwhile, bioinformatics analysis on the carbohydrate active enzymes (CAZymes) includes Trichoderma reesei, Trichoderma virens, Bacillus subtilis XF-1 and BEST195, and Colletotrichum graminicola, Colletotrichum higginsianum, which has been released the complete genome sequence, in order to clear the CAZymes characteristics between antagonism microorganisms and pathogens, and to clear the expression at different times and to validate the functional of CAZymes between the YB-4-15, yb33 and walnut anthracnose use comparative genomics methods, which reveal synergism biocontrol mechanisms between Trichoderma hamatum and Bacillus subtilis against walnut anthracnose provides an important theoretical support, but also further realization of walnut production to provide important pollution-free control measures.

本研究以对核桃炭疽病菌具有较好抑制效果的拮抗菌——钩状木霉YB-4-15和枯草芽孢杆菌yb33为研究对象，通过田间试验以及利用Biolog和PCR-DGGE技术解析微生物群落情况，以期明确上述拮抗菌在田间对于核桃炭疽病的生防效果以及定殖情况、对周围微生物的影响作用以及对于核桃的促生作用情况，同时，通过对已释放全基因组序列的里氏木霉、粘绿木霉等木霉和枯草芽孢杆菌XF-1、BEST195等拮抗菌以及禾谷炭疽菌、希金斯炭疽菌等病原菌分泌碳水化合物活性酶类（CAZymes）的生物信息学进行对比分析，明确拮抗菌和病原菌之间CAZymes特征，并利用比较基因组学方法，对YB-4-15、yb33以及核桃炭疽病菌在不同时期分泌CAZymes表达情况进行分析及功能进行验证，对于全息化揭示钩状木霉与枯草芽孢杆菌对核桃炭疽病的协同作用机制提供重要的理论支撑，也为进一步实现核桃无公害生产提供重要的防治措施。

核桃炭疽病作为重要经济林木上的重大病害，相关基础研究在一定程度上尚落后于国家的发展战略和规划。本研究立足于云南省核桃产业现状及未来发展规划，以前期实验室内所获得的对核桃炭疽病菌具有较好生防效果的拮抗菌——钩状木霉YB-4-15和枯草芽孢杆菌yb33为研究菌株，通过对于室内生防效果以及促生效果研究，明确上述生防菌对核桃炭疽病的协同生防作用比例，以及通过生物信息学分析及试验验证、生防菌在土壤中的定殖效果、生防菌对于土壤根际微生物群落影响等，从代谢产物（酶）、时间和空间竞争作用、对核桃促生作用方面解析钩状木霉与枯草芽孢杆菌对核桃炭疽病的协同生防作用机制。低浓度的钩状木霉及其两者生防菌混合液均对种子萌发有一定的促进结果。通过生物信息学分析，明确禾谷炭疽菌、希金斯炭疽菌均在CAZymes蛋白种类和数量方面具有相对一致性特点，两种炭疽菌中GH数量较多；两种木霉的CAZymes蛋白的种类差异主要表现在GH、CBM、GH/CBM、CBM/GH，两者因CAZymes不同而导致功能不同；两种枯草芽孢杆菌中CAZymes蛋白种类及数量存在着一致性趋势以及部分差异性特点，初步明确了部分CAZymes所具有的功能。钩状木霉定殖范围为2×10^4-5×10^4 cfu/g；枯草芽孢杆菌定殖范围为0.530×10^7-3.205×10^7 cfu/g。对比分析生防菌浇灌在核桃、桂花、香樟以及石楠等不同根际土壤中，明确上述菌株较好地定殖在核桃根际土中。明确实验组（添加生防菌）和对照组中有关真菌和放线菌等微生物的数量之间的差异性均没有达到显著水平，而细菌之间的对照达到了显著性差异；明确土壤理化性质与采样点关系、是否添加生防菌株关系并不显著。通过Biolog技术对核桃根际土壤微生物群落进行研究，明确不同土层土壤AWCD大小顺序为20-40 cm＞40-60 cm＞0-20 cm；土壤微生物群落Shannon指数的总体趋势为20-40 cm＞0-20 cm＞40-60 cm。指导本科生毕业论文20篇，发表SCI论文2篇，专著2部，中文核心期刊24篇。本项目为进一步开发以钩状木霉与枯草芽孢杆菌为主要菌源的生物制剂，以及用于生产上核桃炭疽病防治的无公害生产提供重要的理论基础。