木霉胶毒素合成基因的克隆及其对木霉生防促生功能的分子调控

A biocontrol agent of Trichoderma conferring a wide spectrum activity against several soil-borne diseases has been isolated, after several years' analysis, we found that this strain was also benefit for plant growth promotion. As gliotoxin plays an important role for fungi as a secondary metabolite, we tried to figure out whether gliotoxin biosynthetic gene cluster in Trichoderma participated in plant protection and plant growth promotion. Through bioinformatic analysis, a putative gliotoxin biosynthetic gene cluster containing 8 genes has been identified in Trichoderma genome. To clarify the function of this putative cluster and dissect the relationship between gliotoxin biosynthetic gene and the effects on plant protection and plant growth promotion of Trichoderma, gene knockout and functional complementation test will carry out for phenotypic characterization. In an attempt to assess the roles of these 8 genes in gliotoxin biosynthetic pathway, expression profiles of these 8 genes in each mutant strains will be identified by qRT-PCR. Altogether, we try to discuss the molecular mechanism underlying Trichoderma on plant protection and plant growth promotion based on gliotoxin biosynthetic gene cluster functional analysis.

项目组从土壤中分离得到一株抑菌效果显著、适应能力强的木霉菌株，经过多年的研究示范，结果表明该木霉菌株对多种作物土传病害具有显著的控病效果，且能有效地促进作物生长。胶毒素是木霉菌重要的次生代谢产物，为了研究胶毒素合成基因对木霉菌控病、促生作用的影响，探讨木霉菌生防促生功能的分子调控机制，项目组利用生物信息学方法，对木霉菌基因组胶毒素合成基因进行预测，得到一个由8个基因组成的胶毒素合成候选基因簇；本申请项目拟对簇内8个基因分别进行敲除及功能互补实验，验证候选基因簇的基因功能，通过对突变菌株及功能互补菌株的生物学特性进行分析，研究胶毒素合成基因对木霉菌控病、促生作用的影响，探讨胶毒素合成基因与木霉菌生防、促生功能之间的相关性；最后，通过对8个敲除突变菌株的胶毒素合成相关基因进行表达分析，深入剖析木霉菌胶毒素合成相关基因的表达调控关系，从分子水平上探讨木霉菌生防、促生功能的分子调控机制。

木霉菌是目前为止研究最多、利用最广的生防真菌，不同的木霉菌株通过不同的生防机制对植物病原菌进行抑制，达到控病目的。对木霉菌的生防机制进行深入剖析，有助于实现生防木霉菌的合理高效利用。项目组利用木霉菌与白绢病菌的平板对峙试验对木霉资源进行了拮抗效果的比较分析，发现绿木霉（Trichoderma virens）T23对白绢病菌的抑制率最高，达70.2%，且T23是供试菌株中唯一一株可产生胶毒素的菌株。胶毒素是一种具有抑菌功能的次生代谢产物，为了研究胶毒素合成调控机制及其在T23生防功能中的作用，深入剖析T23的生防分子机制，本项目利用基因敲除技术对挖掘到的木霉菌胶毒素合成候选基因簇内的8个基因（gliI-T，gliP-T，gliC-T，gliM-T，gliG-T，gliK-T，gliN-T，gliF-T）进行同源基因敲除，成功获得基因敲除突变体ΔgliI-T，ΔgliP-T，ΔgliC-T，ΔgliM-T，ΔgliG-T，ΔgliN-T，ΔgliK-T，ΔgliF-T。高效液相色谱检测结果表明，基因敲除后，突变体ΔgliP-T，ΔgliC-T，ΔgliN-T，ΔgliI-T，ΔgliG-T，ΔgliF-T，ΔgliM-T培养液中已检测不到胶毒素的产生，ΔgliK-T胶毒素产出量锐减。平板对峙实验及幼苗接种试验结果进一步表明，胶毒素缺失突变体对白绢病菌的抑制效果大大下降。最后，项目组利用透射电镜观察不同浓度胶毒素对白绢病菌菌丝细胞的影响，结果发现，白绢病菌菌丝细胞超微结构的变化与胶毒素浓度有关，浓度为20μg/mL时，最显著的变化是线粒体脊数量显著减少；当浓度为30μg/mL时，细胞出现严重的坏死。本项目成功挖掘到T23基因组调控胶毒素合成的基因，并明确了胶毒素对植物病原真菌的抑制效果，研究结果结果表明胶毒素的产生对T23行使其生防功能发挥了重要的作用。