2-十三烷酮诱导棉铃虫CYP6B6表达调控机制

昆虫和植物间的化学关系是害虫治理的重要基础。解毒酶系的可诱导性是昆虫对寄主植物适应性的主要机制。明确棉铃虫如何利用植物次生代谢产物作为感应信号提高其适应能力，对于有效控制棉铃虫具有重要意义。该项目主要研究内容包括：1）鉴定棉铃虫CYP6B6启动子区域的2-十三烷酮核心应答元件；2）克隆棉铃虫Nrf2和Keap1基因并通过离体、活体表达系统对其超表达和RNAi，研究其对CYP6B6的表达调控作用；3）2-十三烷酮诱导后Nrf2和Keap1在脂肪体细胞中的定位；4）不同植物次生物质对CYP6B6 2-十三烷酮核心应答元件诱导强度；5）在sf9细胞中表达CYP6B6，测定其对植物次生物质的代谢谱。通过上述研究，探讨棉铃虫利用植物次生性物质作为感应信号提高其适应能力的机制，对于揭示害虫抗药性机制、植食性昆虫与植物的协同进化机制具有重要意义，还可为发展害虫控制新技术以及新农药创制提供依据。

将克隆得到的棉铃虫CYP6B2、CYP6B6、CYP6B7和CYP9A17基因启动子序列连接到报告基因载体pGL4.1basic验证启动子的活性，发现这些序列的启动子活性均能够被2-十三烷酮诱导。通过对克隆得到的棉铃虫CYP6B2、CYP6B6、CYP6B7和CYP9A17基因启动子序列的转录因子结合位点的分析，发现棉铃虫CYP6B2、CYP6B6、CYP6B7和CYP9A17基因均具有抗氧化信号通路Nrf2转录因子的结合位点。其中CYP6B6启动子序列不仅具有Nrf2转录因子结合位点还具有芳香烃受体应答信号通路AhR（转录因子的结合位点。.通过Race法克隆得到棉铃虫抗氧化信号通路中的Nrf2、Keap1和AhR转录因子的基因序列，构建重组质粒pACv5His-Red-Nrf2以及pACv5His-EGFP-Keap1分别与连有报告基因的棉铃虫CYP6B2、CYP6B6、CYP6B7和CYP9A17基因启动子共转染，发现均受Nrf2-Keap1信号通路的调控。由于CYP6B6启动子序列不仅具有Nrf2转录因子结合位点还具有AhR转录因子的结合位点，通过构建不同长度CYP6B6启动子的报告基因载体，发现273 bp长度的CYP6B6基因启动子为2-十三烷酮诱导的核心启动子，这一片段同时包含有Nrf2和AhR转录因子结合位点序列，缺失其中任何一个转录因子结合位点的序列并不影响CYP6B6核心启动子的本底活性以及2-十三烷酮的诱导活性，当同时敲出Nrf2和AhR转录因子结合位点序列时，CYP6B6核心启动子不具有启动子活性，同时2-十三烷酮也不能够诱导其启动子活性。通过EMSA实验证实棉铃虫CYP6B6基因的Nrf2和AhR转录因子结合位点的确能与相应的棉铃虫转录因子Nrf2和AhR结合，并且2-十三烷酮处理能使棉铃虫脂肪体细胞核内的Nrf2和AhR表达量升高，能够激发Nrf2和AhR信号通路的响应。激光共聚焦实验进一步证实了2-十三烷酮处理能使棉铃虫脂肪体细胞核内的Nrf2转录因子表达量升高。运用RNAi干扰Nrf2和AhR转录因子的基因表达量时，我们发现棉铃虫CYP6B6基因的表达是受抗氧化信号通路Nrf2以及芳香烃受体应答信号通路AhR的共同调控。.本文从明确了CYP6B6基因的表达受抗氧化信号通路和芳香烃受体应答信号通路的共同调控.