血管损伤后MMP-14与TGF-β1在新生内膜形成过程中的作用关系研究

Postoperative restenosis of angioplasty or percutaneous coronary artery intervention treatment is the important issue in cardiovascular disease. Neointimal hyperplasia of restenosis is a common characteristics of pathological changes in cardiovascular diseases. To explore the cause of neointimal formation, cell composition and function are important for prevention and treatment of these diseases. Based on previous work, real time quantitative PCR, WB and ELISA have been applied to detect the expression of MMP-14 and TGF-β1. In vitro, MSC and VSMC isolated from S-D rat. The MMP-14 biosensor were transfected into different types of cells. Fluorescence resonance energy transfer（FRET）imagine was utilized to observe the dynamic changes between MMP-14 and TGF-β1 in live cells. In vivo, artery injury animal models are built in rats and gene knockout mice, then to learn the interaction and function of MMP-14 and TGF-β1 in neointimal formation. To study the possible mechanism of MMP-14 and TGF-β1 in mobilizing and recruiting bone marrow MSC to the area of artery injury, promote to VSMC differentiation and the VSMC in tunica media migration to the neointima. And then discuss the mechanism of effective interventions for restenosis after coronary interventional treatment.

血管成形术及经皮冠状动脉介入治疗术后再狭窄是心血管疾病国内外研究的重要方向,新生内膜增生是再狭窄等心血管疾病共同的病理特征。因此研究新生内膜形成的原因、细胞组成及功能对于防治此类疾病有着重要意义。故本课题拟在前期工作的基础上，以大鼠及基因敲除小鼠损伤血管为研究对象，体内和体外实验采用实时定量PCR、WB、细胞转染、FRET技术、酶联免疫吸附实验，MSC和VSMC的分离和培养,细胞迁移实验等技术检测血管损伤后局部微环境及MSC和VSMC中MMP-14和TGF-β1信号转导通路蛋白的表达情况及相互作用,研究MMP-14和TGF-β1在动员和招募聚集骨髓腔的MSC到血管损伤部位,促进其向VSMC分化及中膜VSMC向内膜的迁移，导致血管新生内膜形成整个过程中的作用。进而探讨血管损伤后新生内膜形成的机制并探索针对该通路的有效干预手段，旨在为预防和治疗冠状动脉介入治疗术后冠脉再狭窄提供新思路。

动物实验和临床研究显示血管成形术后再狭窄与内膜增生及血管重塑过程有关，探究血管损伤后新生内膜形成过程及其发生发展机制对有效预防PCI术后再狭窄具有重要意义。本课题通过生物信息学技术对血管损伤模型GEO芯片分析处理，筛选出损伤后再狭窄的差异基因后，建立SD大鼠及基因敲除小鼠颈总动脉球囊损伤模型，体内及体外实验检测血管损伤后局部微环境及间充质干细胞（MSCs）和血管平滑肌细胞（VSMCs）中MMP-14和TGF-β1信号转导通路蛋白的表达情况及相互作用，通过过表达或抑制MMP-14后，观察损伤后不同时间点新生内膜的形态变化并检测其MMP-14、TGF-β1/Smad信号通路相关蛋白、细胞表型相关蛋白和MSCs标记物的表达情况以及对MSCs和VSMCs生物学行为的影响，并探讨血管损伤后MMP-14与TGF-β1的相互作用关系，结果显示：（1）通过生物信息学筛选出MMP-14为差异基因；（2）检测不同时间点SD大鼠正常胸主动脉血管及内膜损伤胸主动脉血管的CM中MMP-14及TGF-β1的表达情况，发现损伤后的CM中的MMP-14，TGF-β1的表达水平明显高于非损伤组；（3）局部应用MMP-14抑制剂后检测到新生内膜增生程度显著降低，并且血管中MMP-14，TGF-β1及其相关信号通路蛋白的表达降低；（4）通过免疫荧光检测应用MMP-14抑制剂后不同时间点内膜MSCs标志物表达，结果显示抑制剂组MSCs标记物表达明显降低，结果提示MMP-14抑制剂可以抑制骨髓中MSCs被招募参与新生内膜的增生过程；（5）体外过表达或抑制MMP-14后可以影响BMSCs和VSMCs的生物学功能以及两种细胞中MMP-14的表达和TGF-β1/smad信号通路的表达情况（6）Co-IP实验及免疫荧光实验检测损伤后14d、21d血管组织中MMP-14和TGF-β1的结合提示两者可能存在相互作用关系；（7）构建MMP-14基因敲除小鼠血管损伤模型后，结果显示敲除MMP-14基因后可抑制新生内膜增生。以上结果提示MMP-14可能通过激活TGF-β1影响BMSCs和VSMCs生物学功能参与到血管损伤后新生内膜形成过程。本研究探讨了血管损伤后MMP-14、TGF-β1在新生内膜形成过程中的作用关系，为治疗血管成形术后再狭窄提供可能的新靶点。