血管损伤后新生内膜的形成及功能与经典TGF-β1信号通路的关系

血管成形术及经皮冠状动脉介入治疗术后再狭窄是心血管疾病所面临的一项难题,狭窄的形成主要是由于血管损伤后新生内膜的形成。因此研究新生内膜形成的原因及功能对于防治血管再狭窄有着重要的意义。.故本课题拟在前期工作的基础上，运用大鼠及小鼠血管损伤模型,采用免疫组织化学,免疫荧光染色, 酶联免疫吸附实验，聚丙烯酰胺凝胶电泳，间充质干细胞的分离和培养,细胞迁移试验,流式细胞仪等技术检测血管损伤后TGF-β1/P-Smad 信号转导通路的激活状态,研究高表达的TGF-β1在动员和招募聚集间充质干细胞(MSC)或者血管前体细胞到内皮损伤部位,促进血管内皮细胞向间质纤维细胞分化，导致血管新生内膜形成过程中的作用。进而探讨血管损伤后新生内膜形成的机制并探索针对该通路的有效干预手段,旨在为预防和治疗血管成形术及动脉介入治疗术后冠脉再狭窄提供新思路。

动物实验和临床研究显示血管成形术后再狭窄的发生与内膜增生及血管重塑有关，因此了解新生内膜中的细胞来源、细胞功能及调控机制为深入研究血管损伤后新生内膜的发生发展及预防干预奠定基础。.本课题以建立大鼠颈总动脉球囊损伤模型为研究对象，检测损伤后TGF-β1的表达情况，局部给予TGF-β1抑制剂、重组剂，观察损伤后不同时间点血管新生内膜的形态变化并检测新生内膜中TGF-β1/Smad信号通路相关蛋白、间充质干细胞（MSCs）标记物的表达情况及外周血和骨髓中MSCs的含量、细胞表型相关蛋白及MMP14蛋白的表达，探讨TGF-β1、MMP-14及MSCs在血管损伤后新生内膜形成过程中所发挥的作用，结果显示：（1）Western blot和免疫组化检测血管损伤后TGF-β1/Smad信号通路蛋白TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3的蛋白表达量，均为7d组开始显著增高，至14d组时表达量最高，21d组中表达量降低，提示：血管损伤后，TGF-β1/Smad信号通路被激活，参与新生内膜的形成；（2）免疫荧光法检测损伤血管中间充质干细胞标记物Nestin和CD29的表达，于7d组和14d组新生内膜管腔面可见阳性细胞分布，且14d组中阳性细胞数显著高于7d组阳性细胞数，结合以上结果提示：TGF-β1/Smad信号通路在血管损伤后内膜增生过程中被激活，可能参与招募间充质干细胞向损伤内膜处聚集；（3）局部血管注射抑制剂组和重组剂组中新生内膜的厚度及增生程度与损伤组比较显著降低，且差异具有统计学意义（p<0.005）；结果提示：TGF-β1抑制剂及重组剂能够有效抑制血管损伤后新生内膜的形成，且二者抑制内膜形成的机制不同；（4）通过流式细胞技术、体外自我更新（CFU-F,CFU-OB）、多向分化潜能测定（成骨、成脂、成软骨）鉴定Sca-1+CD29+CD45-CD11b-的细胞群为间充质干细胞(MSC)。（5）流式细胞术检测损伤组、抑制剂组、重组剂组循环血和骨髓中MSCs的量，结果显示TGF-β1抑制剂可以抑制骨髓中MSCs被招募进入外周血参与血管损伤的修复及血管内膜的增生过程；rhTGFβ1的局部用药和全身用药对MSCs的招募及损伤血管内膜增生的作用机制可能不同。（6）血管损伤后，MMP-14可能参与TGF-β1的活化，二者联合或协同参与损伤血管招募MSC及MSC表型分化的过程。