不同遗传方式视网膜色素变性家系致病基因的发现及相关功能研究

Retinitis pigmentosa (RP) is a group of inherited retinal degenerations characterized by progressive loss of photoreceptor and retinal pigment epithelium cells. Although up to 64 genes have been identified as RP disease-causing genes, these genes account for less than 50% of all patients, the remainder has defects in as yet unidentified genes. From our previous studies, five Chinese Han RP families without mutations in the reported RP genes were identified in Peking University Eye Center. These RP families are very important resources used for novel disease-causing gene study. The objective of this study is to reveal the novel pathogenetic mutations in these RP families, and to illustrate its role in RP pathogenesis. In the present study, we want to investigate (1) RP genetic diagnosis basing on targeted exome capture technology and high throughput sequencing. On the base of genetic diagnosis, mutation spectrum and genotype-phenotype correlation will be analyzed in Chinese RP patients, with RP families without mutations in the reported RP genes will be collected for the following studies; (2) the novel candidate disease genes of these RP families with whole exome sequencing or whole genome sequencing; (3) the functional role of novel candidate disease gene using gene transfection or gene knockdown on ARPE-19 and 661W cells; (4) the pathogenetic mechanism of the novel candidate disease gene using zebrafish model with morpholino knockdown and/or rescue study. Our study try to demonstrate that the identified candidate disease gene is the novel RP disease-causing gene and illustrate its pathogenetic mechanism, which will pave the way for RP genetic diagnosis and consultation, family planning and gene targeted treatment in the future.

视网膜色素变性（RP）是一组以感光细胞和色素上皮细胞进行性、选择性丧失为特点的遗传性致盲眼病。尽管已发现64个致病基因，研究显示仍有大量未知基因有待挖掘。本课题组在前期研究工作中积累了5个由未知基因突变所致的RP大家系样本，为研究RP新的致病基因积累了重要资源。本课题研究目的是发现RP新的致病基因并阐明其致病机制，在此基础上探索可能的治疗方案和预防措施。本研究将借助于高通量测序和Sanger测序，对RP患者提供致病基因诊断，在此基础上探讨中国汉族RP患者的基因突变频谱，以及基因型与临床表型的对应关系；选择由未知基因突变所致的RP大家系，通过外显子组或全基因组测序发现RP新的候选致病基因；在细胞水平上通过基因转染和基因敲除技术探讨该基因的功能；在斑马鱼模型上通过转染和/或敲除同源基因的方法研究其致病机制。以此论证该基因为RP新的致病基因，阐明其致病机制，为将来RP的诊断、预防和治疗提供帮助。

视网膜色素变性是一组遗传性致盲眼病,目前已经发现超过85个致病基因，但只有约50%的RP患者是由上述已知致病基因中的突变所致，提示仍有大量的未知基因有待挖掘。本课题的研究目的是发现RP新的致病基因。研究结果显示：（1）通过外显子捕获高通量测序技术在一个常染色体显性遗传的RP大家系即adRP93（5代中共有12名患者）中发现ADIPOR1基因的杂合突变(c.929A > G, p.Y310C)与该家系的疾病表型共分离，SIFT, Polyphen2和Mutation Taster等生物信息学分析预测该位点为致病性突变；SDM蛋白结构预测结果显示Y310位于α螺旋的中部，且侧链位于整个结构的疏水核心，将Y突变成C后可能会导致蛋白质的结构遭到破坏，丧失其本身所具有的功能；在细胞实验中，野生型蛋白表达于细胞膜上，ADIPOR1突变后会使蛋白无法正常定位在细胞膜上，而是聚集在细胞质内，证明突变后蛋白无法正常折叠及定位；斑马鱼实验结果显示，adipor1主要表达于感光细胞的内节和外节，MO技术敲低adipor1在斑马鱼中的表达，斑马鱼视网膜视杆细胞数量特异性减少，而视锥细胞数量不变，这与RP患者的表型相符。综上所述，我们的研究结果表明ADIPOR1是常染色体显性遗传RP的一个新的致病基因。（2）在另外3个RP大家系和一个常显遗传先天性白内障家系中也找到了新的致病基因，已经完成斑马鱼实验，需要进一步在小鼠模型上进行验证。通过本部分研究发现遗传性眼病新的致病基因和发病机制，为未来的治疗提供理论基础。. 本课题组在有限的经费资助下，（1）对比研究WES和HEDEP在遗传性视网膜变性基因诊断中的优势和缺点，研究结果显示HEDEP同WES相比具有更好的测序覆盖度和测序深度，是临床IRDs基因诊断的首选。（2）对BCD的基因型进行研究，发现中国BCD患者最常见的三个突变热点。（3）对中国1000例IRDs患者的基因型和表型进行分析，发现中国IRDs患者中常见的致病基因和突变热点。通过本部分研究，丰富了中国IRDs患者的基因型和表型对应关系，为未来的临床基因治疗提供基础，基因诊断阴性的大家系样本成为遗传性眼病新的致病基因研究的宝贵资源。