虚寒证与能量代谢基因模块异动关系的研究

前期对虚寒证的基因表达谱和代谢组学进行了系统研究，初步筛选到虚寒证的特征基因25条；提出假说"能量代谢基因模块异动可能是虚寒证的关键病机之一"。立论依据：①初筛的特征基因中ATP合成系统相关基因占25％，用RT-PCR验证已发现2条显著性差异表达；②通路分析结果提示：三羧酸循环通路和氧化磷酸化通路异常；③代谢组学研究肾阳虚动物模型时，亦提示能量产生和利用环节异常。但上述整体水平的研究结果还有待于大样本量的验证，作用机制研究有待深入。鉴此，本项目拟利用定量PCR等技术，从基因表达、酶活性、产能效率等方面检测三羧酸循环模块及呼吸链模块的变化规律，比较典型虚寒证、虚热证及正常对照之间的差别，在基因表达层面揭示虚寒证的分子机理。该项目的实施不但可以丰富和发展中医基础理论；也可以为人类功能基因组研究注入中医内涵，填补传统证候在基因功能注释的空白；也为寻找虚寒证诊断或疗效评价的特异性分子指标奠定基础。

虚寒证是典型的中医证候，对虚寒证“证候”的客观化研究是目前中医学研究的关键和难点。虚寒证所表现出来的畏寒肢冷，神疲乏力，面色皓白等阳虚证候是否和体内能量代谢有关？环境温度的改变是否影响了能量代谢相关基因、蛋白质表达，最终导致产能功能的变化？本项目设立两种不同的环境温度（低温-4℃～5℃、室温23℃～25℃），对正常组、虚寒证组和虚热证组人群抽取肘静脉外周血样，通过实时荧光定量PCR、高效液相色谱（HPLC）、流式细胞仪、氧电极等技术对三组人群在两种不同温度状态下的基因表达、细胞能荷比变化、线粒体膜电位、氧化呼吸活性及三羧酸循环相关酶活性进行了检测，目前实验部分全部完成。结果发现（1）河南中医学院在校大学生体质分布情况为八种偏颇体质排名前三位的是气虚质、阳虚质、阴虚质。其中阳虚质占25.2%，主要的特征表现为手脚发凉、怕冷多衣、不耐寒冷；阴虚质占24%，主要表现为口唇干燥、眼睛干涩、口干咽燥欲饮水。（2）三组人群之间不论是在低温下或是室温下基因表达情况均存在差异。其中P2X5受体、IDH1、IDH2基因在虚寒证组的表达较低；虚寒证组SLC4A8的表达值较高。特别是P2X5受体，组间比较：不论在低温还是在室温状态下，虚寒证、虚热证P2X5受体表达低于正常组（P＜0.05）；组内比较：三组组内P2X5受体在两种温度下的表达均无差异（P＞0.05）。（3）与能量生成和利用有关的线粒体内膜呼吸传递链的五个复合体存在活性异常。其中虚寒证线粒体复合体Ⅰ（NADH-CoQ氧化还原酶）、复合体Ⅱ（琥珀酸-泛醌还原酶）在两种环境温度下，与正常组比较活性值均降低（P＜0.05），虚热证组复合体Ⅰ、复合体Ⅱ活性值均升高；低温下三组复合体Ⅰ、复合体Ⅱ活性值增大，且正常组两种温度下复合体Ⅰ活性调节速率存在差异。（4）通过流式细胞技术检测线粒体膜电位发现，不同温度状态下不同组别间膜电位变化趋势不同，其中虚寒证组均低于其他两组；组内比较，正常对照组：寒温＞室温；虚寒证组和虚热证组：室温＞寒温。.本课题从基因表达、蛋白酶活性水平监测了能量代谢在中医不同证型间的变化规律，阐释了外界环境温度的变化对机体产能效率的影响，在分子水平上为虚寒证典型的“畏寒肢冷”等证候特征提供了直接证据。论证了“能量代谢的异动可能是虚寒证病机之一”假说的科学性。