半乳糖基甘油酯抑菌作用分子机理研究

Galactosylglycerides (GalGs) are important signal and regulatory molecules existed in plants and bacteria and are capturing the growing interests of researchers because of their different bioactivities. It was reported that GalGs presented good antimicrobial acitivity against both gram-positive and gram-negative bacteria. However, the exact mechanism of of action of GalGs remains until today unclear. Here, with Bacillus cereus as targeted bacteria, the cell damage effects of GalGs will be evaluated by determining the changes of permeability and integrity of cell wall and cytomembrane, as well as the changes of cellular morphology. Then transcriptomic technique (RNA-seq technology), proteomic technique(iTRAQ) and metabolomics technique based on LC-MS analysis combined with bioinformatics technique will be applied to compare the change law and expression differences of transcriptome, transcriptome and metabolite under the conditions of with and without the presence of GalGs. The antimicrobial molecular mechanism and targeted action sites of GalGs will be elucidated. This work will provide scientific evidence for the innovation design and synthesis of new GalGs, and lay a theoretical foundation for the production of high effective, safe and natural food preservation.

半乳糖基甘油酯是植物和细菌体内一类重要的信号调控分子，近几年因其具有多种生物活性而备受关注。研究表明，半乳糖基甘油酯对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有很好的抑菌效果，但其具体抗菌作用机理尚不清楚。为此，本项目拟以蜡样芽孢杆菌为目标微生物，通过细胞壁和细胞膜的通透性和完整性、菌体细胞形态等的变化从细胞水平评价半乳糖基甘油酯的细胞损伤效应。应用转录组学（RNA-seq技术）、蛋白组学（iTRAQ）和代谢组学（基于LC-MS）等“组学”技术结合生物信息学手段比较不同半乳糖基甘油酯处理情况下菌体转录组、蛋白组和代谢组的表达变化规律和差异，明确半乳糖基甘油酯的作用机理和作用靶点。本项目开展的研究工作可以为设计、合成新型半乳糖基甘油酯类抗菌物质提供科学依据，为开发高效、安全、天然的甘油糖脂类食品防腐保鲜剂奠定理论基础。

为了明确半乳糖基甘油酯的作用机理和靶点，为其设计合成和应用提供理论和技术支撑，本文以半乳糖基月桂酸单甘酯为抑菌剂，从细胞和组学水平对其抑菌分子机理进行研究。结果发现，MGML可以抑制短小/蜡样芽孢杆菌的生长，使其延滞期增长，高浓度下具有杀菌作用。膜的通透性、完整性、TEM和SEM结果发现，MGML可以改变菌体细胞膜的完整性和通透性，引起内容物泄露，导致菌体的死亡。细胞流氏术发现，MGML可以改变菌体内ROS含量，凝胶阻滞实验和琼脂糖凝胶电泳表明，MGML还可以影响菌体的核酸和蛋白质的合成，从而抑制其生长。通过亚致死浓度MGML作用，在0.5h 和1.5h下进行蜡样芽孢杆菌的转录组学研究发现，有1778和1302个显著差异基因，GO和KEGG分析表明，这些显著差异基因涉及到的糖酵解、三羧循环、脂肪酸代谢过程和相关酶基因大部分表达上调，与肽聚糖合成和细胞膜合成的相关基因表达也上调，这些基因的上调可以增加菌体对外界环境刺激的抵抗，加强菌体自身的修复，有利于菌体的恢复。另外， MGML作用下，与菌体生长繁殖、呼吸代谢和离子转运相关的基因的表达水平也发生显著变化。代谢组学结果发现，MGML作用下，50多种显著差异差异代谢物，KEGG分析表明，这些物质主要为糖类、氨基酸、脂肪酸和核苷酸类物质，这些物质的变化会导致菌体内合成生物大分子合成的变化，从而影响这些生物大分子参与的代谢活动的变化，进而导致菌体的代谢紊乱，生长受阻或死亡。将代谢产物的变化与转录组基因表达的变化相联系，可得到MGML处理蜡样芽孢杆菌后，主要对蜡样芽孢杆菌的能量代谢（碳代谢、脂肪酸代谢、氮代谢）、核酸代谢、呼吸代谢、细胞壁和细胞膜的生物合成以及物质的跨膜运输等途径产生影响，导致菌体内的代谢紊乱，破坏其正常的生长繁殖，最终达到抑制菌体生长的效果。本研究成果为半乳糖基甘油酯的设计、合成和应用提供了一定的理论和技术基础。