半乳糖基甘油糖脂的酶促合成及其抗菌活性和机理研究

It is an urgent affair in food industries to search a broad spectrum, high effective,safe and natural food preservation. Recently,the antimicrobial activities of bio-surfactants are getting more and more attention. However,there are few reports about the antimicrobial activity and mechanism of glycoglycerolipids. The project aims to selectively synthesis of different galactosylglycerolipid with different fatty acid chains through enzymatic reaction in aqueous medium. On the base,the synthesized galactosylglycerolipid will be used to investigate its antimicrobial activity against food spoilage bacteria, and the antimicrobial mechanism will be studied on a cell and molecular level. The project will clear the relationships of antimicrobial activity -structure of galactosylglycerolipid, and illuminate the antimicrobial mechanism. These work will provide the theoretical foundations for the innovation design and synthesis of new glycoglycerolipids, and the production of high effective, safe and natural food preservation, as well enrich the kinds of natural food preservations.

寻求广谱、高效、安全、天然的食品防腐剂是食品工业发展的当务之急。最近几年，糖脂类生物表面活性剂的抗菌活性受到研究者的极大关注，关于甘油糖脂抗菌活性及其抑菌机理的研究鲜有报道。本项目旨在通过微水介质中脂肪酶催化的选择性脂酰基化反应合成各种具有不同脂肪酸链长、饱和度的半乳糖基甘油单酯和二酯的基础上，研究其对食品中常见腐败菌（革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、霉菌）的抗菌活性（MIC、MBC）及影响其抗菌活性的相关因素，并从细胞和分子水平上研究其抗菌机理，明确甘油糖脂的抗菌活性构效关系，并阐明其作用机理。本项目开展的研究工作可以为设计、合成新型甘油糖脂类抗菌物质以及为开发高效、安全、天然的糖脂类食品防腐保鲜剂提供理论基础,同时也丰富天然食品防腐剂的品种。

为了寻求一种广谱、高效、安全、天然的食品防腐剂，本项目为半乳糖基甘油糖脂为研究对象，通过β-半乳糖苷酶催化甘油和D-半乳糖糖苷化反应制备了甘油半乳糖苷，通过单因素及响应曲面优化法获得其最佳酶促反应条件为温度39.75 ℃，反应时间48 h，酶浓度为350 U/mL，底物摩尔比为8.65:1，即甘油16 mmol，半乳糖1.85 mmol，在此条件到最高产量为140.03±5.87 mg/mL，半乳糖转化率为55.71±2.33%，并建立了活性炭柱法分离纯化甘油半乳糖苷的方法，产物回收率为76.95%，纯度为98.33%。采用MS及多种NMR方法对纯品进行结构鉴定，得到甘油半乳糖苷结构为关于甘油2-位的顺反异构体：(2R)-/(2S)-3-O-β-D-吡喃半乳糖基-sn-甘油，两种同分异构体的比例为1:1。以此甘油半乳糖苷为底物，己酸（短链酸）、 月桂酸（中链酸）和棕榈酸（长链酸）为底物，在脂肪酶催化的酯化反应下制备半乳糖基甘油酯，通过单因素和响应曲面法建立了三种半乳糖基甘油酯的最佳反应条件，最终产物产率分别为半乳糖基甘油己酰酯88.08%；半乳糖基甘油月桂酰酯89.21%；半乳糖基甘油棕榈酰酯90.17%。在此基础上制备了多种半乳糖基甘油酯： C10、C18、C18:1、C18:2、，采用柱层析法对所获得产物进行分离纯化并采用MS及NMR方法对产品结构进行鉴定，鉴定所得产物为1-O-脂酰基-3-O-β-D-吡喃半乳糖基甘油或3-O-(6’-O-脂酰基-β-D-半乳糖基)-sn-甘油和1-O-脂酰基-3-O-(6’-O-脂酰基-β-D-吡喃半乳糖基)- sn-甘油。将所制备的甘油半乳糖苷、半乳糖基甘油单酯和半乳糖基甘油二酯进行体外抗菌活性，发现甘油半乳糖苷没有抗菌活性，半乳糖基甘油酯对所测细菌均有抗菌活性， 对酵母和霉菌无效。酰基链长度对半乳糖基甘油酯的抑菌活性影响较大，半乳糖基甘油月桂酸单酯的抑菌效果最好，对G-的 MIC 为 78 μg/mL，对 G+的 MIC 为 156 μg/mL。对半乳糖基甘油月桂酸单酯抑菌机理的进一步研究发现，半乳糖基甘油月桂酸单酯可能作用于细菌的细胞壁和细胞膜， 使其通透性增大，完整性破坏，造成胞内蛋白、核酸的泄漏，并进一步影响胞内DNA和蛋白质的合成。研究成果为新型食品防腐剂的开发和利用奠定了坚实的基础。