天名精内酯酮抑菌作用分子靶标研究

Carabrone, a sesquiterpene lactone isolated from Carpesium macrocephalum, exhibits potent antifungal activity and could be served as the promising starting point for development of new fungicides. Sponsored by the National Natural Science Foundation of China (No. 31272074), our preliminary works have demonstrated that carabrone is subcellularly localized in mitochondria of Gaeumannomyces graminis var. tritici . Walker and has inhibitory impacts on the respiratory chain. Taken together, the preliminary results identified that the specific target proteins of carabrone is localized in mitochondria. In the present research, small-molecule affinity chromatography, drug affinity responsive stability analysis, protein complex co-immunoprecipitation and bioinformatics analysis are employed together to identify the potential target proteins of carabrone in mitochondria of G. graminis. Moreover, microscale thermophoresis, homology modeling and molecular docking simulation, site-directed mutation, and protein–compound co-crystallization techniques are used to confirm the targets of carabrone. This research will elucidate the mode of action of carabrone and provide the useful clues for the design novel fungicides.

天名精内酯酮是从菊科天名精属植物大花金挖耳中分离得到的卡拉布烷型倍半萜内酯类化合物，项目申请人首次发现其优异的农用杀菌活性，系统测试表明该化合物具备开发为新型杀菌剂的潜质。申请者在国家自然科学基金（31272074）的资助下，完成了天名精内酯酮在小麦全蚀病菌菌丝的亚细胞定位，其作用细胞器为线粒体，同时对线粒体呼吸链存在明显的抑制作用，这些结果说明线粒体内存在天名精内酯酮特定的大分子靶标。本项目拟在此基础上，以小麦全蚀病菌为试材，采用亲和层析和DARTS技术识别化合物结合蛋白，结合免疫共沉淀技术和生物信息学分析筛选疑似靶标蛋白，进一步在疑似靶标蛋白亚基原核表达和纯化基础上，采用微量热泳动分析、同源建模和定点突变以及疑似靶标蛋白晶体制备与分析等技术对天名精内酯酮分子靶标进行确证。研究结果将为天名精内酯酮抑菌分子机理提供直接证据，为该类化合物的生物合理设计及新型杀菌剂的创制提供科学依据。

天名精内酯酮是从菊科植物大花金挖耳中分离得到的一种新农用抑菌活性化合物，前期研究证实其主要作用于线粒体，但其靶标蛋白尚不明确。在此基础上，本项目以小麦全蚀病菌为供试菌种，对其靶标蛋白进行研究，主要结果如下：..【1】天名精内酯酮对线粒体复合体III铁硫蛋白（ISP）亚基有显著影响。小麦全蚀病菌GgISP沉默菌株对天名精内酯酮药剂敏感性降低、酶活性无显著变化，而过表达菌株敏感性增加。该结果说明天名精内酯酮对线粒体复合体III铁硫蛋白（ISP）亚基有显著影响，对此有待进一步验证。..【2】转录组分析表明天名精内酯酮对氧化磷酸化和自噬通路有显著影响。天名精内酯酮处理后的小麦全蚀病菌转录组分析显示，天名精内酯酮在1-4 h显著下调氧化磷酸化通路相关基因，并且上调自噬通路相关基因。该结果为天名精内酯酮靶标蛋白的筛选提供了依据。..【3】亲和层析和基于活性蛋白质谱分析（ABPP）等化学蛋白组学方法筛选到43个疑似靶标蛋白，主要涉及氧化磷酸化和NAD+/NADH转化等相关蛋白，但未筛选到线粒体复合体III铁硫蛋白（ISP）亚基。..【4】线粒体复合体I是天名精内酯酮的靶标蛋白。天名精内酯酮抑制线粒体复合体I的活性，降低NAD+/NADH的比值，并显著增加超氧阴离子的产生。NAD+正交途径和基因沉默进一步表明，线粒体复合体I是天名精内酯酮的靶标蛋白之一。..综上可见，天名精内酯酮作用于病原菌线粒体复合体I，影响氧化磷酸化过程，而其对线粒体复合体III的影响可能是后效应。分析认为天名精内酯酮的抑菌机理为：天名精内酯酮抑制线粒体复合体I的活性，破坏线粒体NAD+/NADH稳态，阻碍电子传递链进程，降低细胞ATP水平，进一步导致活性氧迸发（超氧阴离子），进而激活线粒体介导的细胞凋亡，最终导致菌体死亡。天名精内酯酮与线粒体复合体I结合的作用位点尚需进一步研究，同时其与自噬的关系也值得进一步探讨。..项目结果为揭示天名精内酯酮的抑菌分子机理提供理论依据，为以天名精内酯酮为先导的新药分子设计及基于靶标的药物合理设计奠定基础。.