新城疫病毒I 系苗（Mukteswar）的进化及其毒力增强的分子机制

前期研究中获得了I系苗Mukteswar的毒力增强毒株JS/7/05/Ch，但其毒力增强的原因目前还尚不清楚。为了研究I系苗毒力增强的分子机制，本项目将对I系苗及其强毒株的全基因组序列和致病性进行分析，系统研究它们各基因的遗传变异、结构蛋白氨基酸的位点差异以及致病性差异。同时以I系苗经鸡体内反复传代，测定不同代次毒株的生物学特性及基因组序列，研究鸡体内I系苗基因进化与毒力变异之间的关系。利用反向遗传技术构建Mukteswar全基因组cDNA感染性克隆，将强毒株JS/7/05/Ch变异基因分别或同时替换到Mukteswar全长基因组中，并进行突变株的拯救，通过突变株的细胞感染试验和动物致病试验，分析引起I系苗毒力变化的关键基因及氨基酸位点，最终确定决定I系苗毒株毒力增强的基因和氨基酸位点，进而明确I系苗毒力增强的分子机制。

通过评估两株不同毒力的基因III型NDV JS/7/05/Ch株和Mukteswar株在感染4周龄SPF鸡后的脾脏、法氏囊、胸腺和肺脏中病毒的复制能力，以及免疫相关细胞因子的表达情况表明，与Mukteswar相比，JS/7/05/Ch在机体内的高效复制及其诱导的促炎性细胞因子早期的大量表达，是造成机体严重损伤的主要原因。. 通过反向遗传操作成功拯救出了四株NDV。MDT和IVPI测定结果显示拯救的病毒与原始母本病毒相似，但表达JS-7122株HN蛋白病毒的IVPI值要明显高于表达Muk-4株HN蛋白的毒株，结果表明HN基因是Mukteswar株毒力增强的主要分子基础。..基因 Ⅲ 型NDV临床分离株JS/7/05/Ch为典型的强毒，但其基因组却与Ⅰ系苗Mukteswar株具有99%以上的相似性，据此分析该强毒应该由Ⅰ系苗Mukteswar株进化而来。对得到的四株空斑纯化株进行IVPI值的测定。结果显示JS-7122和JS-1217的IVPI值分别是2.2和2.15，而Muk-4和Muk-5的IVPI值分别为0.03和0.09。为了探索影响Mukteswar株NDV毒力增强的关键性基因，我们对JS-7122和Muk-4进行全基因组测序并对所测序列进行比对分析，结果显示两株病毒的差异位点主要集中在NP、HN和L基因上，P、M和F基因则完全一致。NP基因有3个核苷酸的差异，其中第1433nt变异引起氨基酸位点的变化；HN基因有6个核苷酸位点的差异并均引起氨基酸的变化；L基因有5个核苷酸位点的差异，但均未引起氨基酸的突变。通过三维结构模拟可以发现HN蛋白的4个差异位点均在HN蛋白的表面，并且494和495位的氨基酸正处于HN蛋白的抗原表位site12内，我们推测该基因很可能是导致这两株 Ⅲ 型NDV毒力差异主要因素。