高通量测序研究microRNAs在调控猪卵母细胞成熟中的作用

Although oocyte in vitro maturation (IVM) has become an essential technique for animal reproduction and human infertility treatment, the developmental potential of IVM oocytes is inferior to that of their in vivo matured (IVO) counterparts. Selection of competent oocytes before IVM is crucial for successful embryo production. Thus, it is of great importance to study the role of miRNAs in regulating maturation and improve oocyte developmental competence. In this study, we will first establish IVM systems that produce pig oocytes with different developmental competences. Then, high-throughput sequencing and bioinformatics analysis of mRNAs and miRNAs will be carried out in cumulus cells (CCs) following oocyte maturation under different IVM systems to identify the oocyte maturation-related miRNAs (OMR-miRNAs). Then, levels of OMR-miRNAs in CCs or conditioned medium (CM) from oocytes matured under different IVM systems will be assayed by RT-qPCR and the expression of OMR-miRNAs in CCs will be up- or down-regulated and by over-expression and interference expression of miRNAs to verify the OMR-miRNAs. Our expected results will not only develop an objective, accurate, fast and affordable test for assessment of oocyte developmental competence but also have important significance for exploring the regulation mechanism of miRNAs on oocyte maturation.

尽管卵母细胞体外成熟（IVM）已成为动物繁殖及人类不孕症治疗的重要技术，但目前IVM卵子的发育能力远低于体内成熟（IVO），其中的关键是挑选最具发育潜能的卵母细胞进行成熟培养和/或受精。因此，研究miRNAs调控卵母细胞成熟的作用机制，提高IVM卵母细胞质量，是当今生殖领域的研究重点。本项目通过建立发育能力不同的猪卵母细胞IVM体系，对卵丘细胞（CCs）进行mRNA和miRNA高通量测序和生物信息学分析，获得与卵母细胞成熟质量相关的miRNAs（OMR-miRNAs）。然后，通过荧光定量PCR、miRNA干扰和过表达，检测不同培养体系成熟（包括IVO）卵子的CCs和条件培养基中的OMR-miRNAs表达水平与卵母细胞发育能力的相关性，筛选出OMR-miRNAs。预期成果不仅能研制既不损伤卵母细胞，又能客观、准确、快速地判断卵子质量的新方法，而且对于探索卵母细胞成熟的调控机理具有重要意义。

目前，评估卵母细胞质量主要根据卵丘-卵母细胞复合体（COCs）和所产生胚胎的形态，但其准确性不尽人意。卵丘细胞与卵母细胞二者的命运息息相关，其凋亡和扩展水平已被作为卵母细胞发育能力的评价指标。已有人提出，用miRNAs作为标志物进行疾病诊断或胚胎挑选。然而，对于调控卵丘细胞扩展和/或凋亡的miRNAs，还没有系统的筛选和验证。我们通过建立猪和小鼠卵母细胞不同发育能力的体外成熟及体内成熟模型，筛选和验证调控卵丘细胞扩展和/或凋亡的miRNAs。高通量测序筛选的候选miRNA进行过表达或敲低实验验证证明，miR-212-5p和149-5p通过上调Has2表达促进卵丘扩展；miR-31-5p和27a-3p通过促进Has2和Ptx3二者的表达促进卵丘扩展；miR-351-5p和503-5p通过下调Ptx3的表达而抑制卵丘扩展。此外，miR-212-5p、149-5p和Nov798是小鼠卵丘细胞凋亡相关的miRNAs，它们通过Bcl2/Bax和Fas信号抑制卵丘细胞凋亡。通过建立猪体内成熟前和体外成熟后两组卵丘扩展凋亡差异模型，进一步证明，ssc-miR-149-5p和miR-31-5p均可通过激活TGF-β信号通路促进卵丘扩展和抑制卵丘细胞凋亡。其中q-PCR检测和双荧光素酶报告基因证明，ssc-miR-149可直接靶向SMAD6的3’UTR下调SMAD6表达，进而调控激活TGF-β信号通路。总之，通过项目的执行，我们筛选并验证了一批新的miRNAs，它们既可用作卵母细胞质量评价的生物学标记，又为探索卵丘细胞调控卵母细胞成熟的机制奠定了基础。