单细胞测序鉴定猪卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的长链非编码RNA及其功能研究

Long non-coding RNAs (lncRNA) have been shown to play vital roles in a wide variety of normal biological processes, and disease development as well. However, their functional involvement in pig oocyte meiosis and early embryo development has not been elucidated. We found previously that lncRNAs were abundantly expressed in pig germinal vesical oocytes, suggesting lncRNAs could play important roles in the regulation of pig oocyte meiosis maturation. In this project, we will identify pig lncRNAs expressed in different developmental stages of oocytes and early embryos, using single cell transcriptome sequencing (RNA-seq); analyze lncRNAs specific to pigs, and differentially and specifically expressed at different developmental stages of pig oocytes and early embryos, using bioinformatics analysis; validate and locate selected lncRNAs, using quantitative real-time RT-PCR and in situ hybridization; reveal the function of selected lncRNAs, using RNAi. In all, we will identify lncRNAs in pigs, and clarify the molecular function of selected lncRNAs in pig oocyte meiosis and early embryo development.

长链非编码RNA（lncRNA）在多种正常生物学和疾病发生过程中发挥着重要调控作用，但其在哺乳动物卵母细胞的减数分裂成熟和早期胚胎发育上的功能机制尚未阐明。本课题组的前期研究结果表明，大量lncRNAs存在于猪生发泡期卵子中，暗示其与卵母细胞的减数分裂成熟密切相关。本项目将在此基础上，利用最新单细胞转录组测序技术，系统测定猪不同时期卵和早期胚胎中表达的lncRNAs；利用生物信息学方法分析转录谱数据，鉴定各发育阶段时期特异/差异表达的lncRNAs；利用定量PCR和原位杂交技术等，对筛选出的lncRNAs进行表达验证和亚细胞定位研究；利用RNAi技术，揭示lncRNAs的功能。通过本项目研究，力图鉴定猪卵和胚胎中大量表达的lncRNAs, 并阐明特定lncRNAs在猪卵成熟和早期胚胎发育中的功能。

长链非编码 RNA（lncRNA）在多种正常生物学和疾病发生过程中发挥重要调控作用，但其在哺乳动物卵母细胞减数分裂成熟和早期胚胎发育上的功能机制尚未阐明。本项目利用最新单细胞转录组测序技术，测定猪GV卵表达8880个LncRNAs，MII表达5964个，体外受精1-细胞胚胎（IVF1）表达8330，IVF2表达6237，IVF4表达5475， IVF8表达3741；孤雌1-细胞胚胎（PA1）表达7030，PA2表达5479，PA4表达5462，PA8表达3496；成对分析发现MII相对GV期卵母细胞（MII/GV）差异表达的LncRNAs基因为313个，体外受精1-细胞胚胎相对于MII期卵母细胞（IVF1/MII）是64个，IVF2/IVF1是169个，IVF4/IVF2是1355个，IVF8/IVF4是0个，而PA1相对于MII期卵母细胞（PA1/MII）是306个，PA2/PA1是373个，PA4/PA2是982个，PA8/PA4是1个，显示4细胞是猪母胚转换时期。GO和KEGG富集分析显示差异LncRNA基因参与多种重要的调控信号通路。进而，我们利用定量 PCR 对测序筛选出的一些差异LncRNAs 进行了表达验证，从验证的结果同时结合生物信息学对靶基因的预测，筛选出一个新的LncRNA（编号LncRNA2193）进行进一步功能分析。利用显微注射特异的siRNA 进入猪GV期卵母细胞可以有效地敲低LncRNA2193的水平，抑制生发泡破裂（GVBD）的发生率，提高核型异常卵母细胞的比例，降低第一极体排出的比率。扰低LncRNA2193也扰乱卵母细胞中微丝和纺锤体的组装，通过改变相关的甲基化和去甲基化酶而降低DNA 5mC甲基化和组蛋白H3在K4/K9/K27/K36位点上的三甲基化修饰的总体水平，但并不改变RNA m6A甲基化修饰的水平。 敲低LncRNA2193也改变全能性、氧化应激、凋亡、线粒体相关和部分预测靶基因的mRNA表达水平。敲低GV卵中的LncRNA2193也诱导孤雌胚胎碎裂率升高从而降低分裂率。综上，本项目鉴定了猪生殖细胞中大量新的LncRNAs,丰富了LncRNA公用数据库，探索了母源LncRNA2193对卵母细胞成熟和后续发育能力的重要调控作用，为后续深入研究更多LncRNA的调控作用提供了可靠的数据信息。