常见果蔬中诺如病毒吸附受体的解析及其分布规律

Norovirus is one of the major pathogens in the outbreaks of non-bacterial epidemic diarrhea. Norovirus can be detected from vegetables and fruits, which cause cross-contamination during the processing and handling procedures. However, until now, little is known about the receptors of norovirus and its distributions in those products. In this study, an Ice nucleation protein, named InaQ, will be used as a vehicle. The core membrane binding domain of InaQ will be determined by the deletion mutant library of the N- terminal domain. The membrane localization of this domain will be analyzed. Then, a cell surface display system will be constructed using membrane binding domain as a carrier protein, the main capsid protein (VP1) of norovirus as passenger protein and Escherichia coli as the recipient strain. The constructed cell surface display system will be used as a surrogate to collect the receptors of norovirus from the vegetables and fruits. The receptors will be evaluated by 2-D electrophoresis, mass spectrometry, and so on. Furthermore, the VP1 binding sites will be investigated to figure out the distribution of this virus's receptors in vegetables and fruits. The results from this study will offer theoretical basis and technical supports to the researches of the detection methods and contamination mechanisms of norovirus from fresh products.

诺如病毒是非细菌性流行性腹泻的最主要病原之一，可污染果蔬类农产品，且在加工处理过程中极易导致交叉污染。目前，果蔬中诺如病毒的吸附受体及其分布规律还知之甚少。本项目拟以冰晶核蛋白InaQ作为载体，通过构建InaQ的N末端缺失突变体库，利用膜定位分析方法，获得该蛋白的膜结合核心结构域；以该结构域为载体蛋白，以诺如病毒衣壳蛋白（VP1）为乘客蛋白，以大肠杆菌为受体菌，构建VP1全细胞表面展示体系。以展示体系作为诺如病毒的替代物，收集与受体结合的表面展示重组菌，利用双向电泳和质谱分析等技术，解析并验证果蔬中诺如病毒吸附受体。同时，在多种常见果蔬样本中进行诺如病毒吸附受体定位分析，考查该病毒吸附受体在果蔬中的分布规律。本课题的实施将为果蔬类农产品中诺如病毒的检测方案和污染机制提供理论依据和技术支撑。

人源诺如病毒（human norovirus, hNoV）是非细菌性流行性腹泻的最主要病原之一。生菜是hNoV吸附及传播的重要载体之一。了解生菜中hNoV吸附介质的分布规律及组成成分，是阐明生菜吸附病毒及传播机制首要问题。由于该病毒暂无有效的体外增殖模式，且不易收集观察，阻碍了其与生菜互作机制的研究。为克服上述技术瓶颈，本项目以冰晶核蛋白InaQ作为载体，通过结构预测和异源表达的跨膜分泌活性结构域分析验证，获得该蛋白膜结合核心编码区为N末端结构域前175个氨基酸（InaQN）。以InaQN为载体蛋白，分别构建了hNoV原型株GI.1型和流行株GII.4型主要衣壳蛋白（VP1）及P结构域大肠杆菌细胞表面展示体系。通过膜定位分析和展示性能评估实验，结果表明表达的融合蛋白InaQN-VP1（GI.1），InaQN-VP1-P（GI.1），InaQN-VP1（GII.4），InaQN-VP1-P（GII.4）均成功锚定于大肠杆菌细胞表面，并具备与hNoV相同的免疫原性和已知受体血组织抗原（HBGAs）结合能力。在此基础上，通过激光共聚焦免疫荧光显微镜观察表面展示重组菌在生菜叶面分布。结果表明，hNoV更易结合老生菜叶，且可分布于生菜叶面、叶脉和气孔。该分布规律解释了简单水洗无法有效清除生菜叶面附着病毒的原因，并能使病毒的检测更具靶向性。通过生菜叶面/叶脉提取物与表面展示重组菌互作分析，揭示了生菜叶面与病毒结合的介质为类HBGAs物质；其中，多糖在病毒与生菜结合过程中起主要作用，且不同基因型病毒与生菜的结合组分有差异。该研究结果丰富了病毒传播机制的研究内容，为进一步探究人源诺如病毒与果蔬互作机制提供了理论依据。