牡蛎富集诺如病毒季节性变化规律的分子机理

牡蛎是诺如病毒（Norovirus，NoV）食源性传播的重要载体，具有特异性和季节性富集NoV的特点。牡蛎消化系统存在NoV的受体即A型组织血型抗原（HBGAs），这解释了牡蛎特异性富集NoV的内在原因，而牡蛎季节性富集NoV的机理研究国内外尚无报道。本研究提出受体表达量存在季节消长变化从而导致牡蛎富集NoV具有季节性规律这一假设，以长牡蛎为研究对象，利用ELISA分析受体表达量的季节变化规律，利用RACE技术确定A型HBGAs的合成关键基因，利用实时荧光定量RT-PCR明确合成关键基因的转录规律。通过本研究，确定长牡蛎A型HBGAs合成的关键基因，阐明牡蛎富集NoV的季节性规律、A型HBGAs表达量的变化规律与其合成关键基因表达规律三者之间关系，从DNA-mRNA-蛋白三个层面揭示牡蛎富集NoV季节性规律的分子机理，为科学防控NoV食源性暴发提供理论依据。

本研究以太平洋牡蛎类A型HBGA合成途径中的关键酶α-1,2-岩藻糖基转移酶（类FUT2）为研究对象，开展了类FUT2基因克隆与时空表达的研究，以期在分子水平上揭示牡蛎季节性富集NoV的机理。.通过同源克隆的方法获得太平洋牡蛎类FUT2基因的cDNA序列（GenBank登录号KJ184342）。结果表明，类FUT2基因cDNA全长为1941 bp，包含180 bp的5΄非翻译区、编码361个氨基酸的1086bp的开放阅读框以及675 bp的3΄非翻译区。分子进化聚类分析结果显示，类FUT2基因与家鼠等哺乳动物的FUT2基因聚为1个分支。.对类FUT2基因密码子优化后，构建重组原核表达载体pRSET-mof，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后用SDS-PAGE检测分析目的蛋白的表达状况，并通过6×His-Tag标签的单克隆抗体和人类FUT2的单抗分别进行western blotting检测。结果显示，类FUT2基因在原核表达系统中成功表达，蛋白大小约为48 kDa，与类FUT2理论值相符，并且可以与抗人类FUT2的单克隆抗体结合。.针对类FUT2基因序列设计实时荧光定量RT-PCR引物，采用SYBR Green染料法，以β-actin为内参基因，基于Delta-Delta CT相对定量法，建立类FUT2基因的实时荧光定量RT-PCR检测方法，开展类FUT2基因表达量的分析，对该基因在牡蛎不同组织、不同季节的时空表达特点进行研究。结果表明，在牡蛎肝胰脏、闭壳肌、外套膜、唇瓣和鳃5个组织中均能检测到类FUT2基因mRNA的存在，且唇瓣中的表达量最低，其余4个组织中的表达量无显著差异（P<0.01）；同时对其季节性表达差异进行了分析。通过牡蛎类A型HBGA的ELISA检测，发现类A型HBGA的含量在8月至次年5月的含量普遍较高，其中在1~3月份其含量呈现下降趋势，3~5月份呈现上升趋势，6~11月份总体处于上升趋势，而8~11月份均具有较高的含量。证实牡蛎类FUT2基因mRNA的分布规律与牡蛎类A型HBGA含量的季节性分布趋势存在一定相关性。.本项目完成计划书中全部研究内容，达到研究目标，发表论文5篇（全标注），其中SCI论文2篇。本研究为探索牡蛎特异性富集NoV的分子机制奠定研究基础。