唐菖蒲抗病基因NPR1的克隆与功能分析

唐菖蒲是世界著名的球根花卉，在我国广泛栽培。但是由于长期的无性繁殖，使其种性退化严重，生产中容易感染各种病害，造成唐菖蒲种球和切花产量与品质的下降，是制约我国优质、高效唐菖蒲生产的主要限制因素之一。NPR1不仅对系统获得抗性和诱导系统抗性起核心调控作用，而且也是基础抗性以及由抗病基因决定抗性的重要调控因子。此外，NPR1还可以通过转录因子TGA的互作来调控PR1基因的表达和抗性的产生。在拟南芥中过表达NPR1与TGA2基因，诱导了下游PR基因的表达，提高了植株的抗病性。本项目拟克隆唐菖蒲NPR1和转录因子TGA2基因，通过转基因拟南芥npr1突变体以及野生型中验证NPR1和转录因子TGA2的互作协调作用，以及分析NPR1基因的广谱抗病性功能，最后将NPR1功能基因转入唐菖蒲，为通过基因修饰手段有效提高唐菖蒲的抗病性，创造优良的、具有自主知识产权的唐菖蒲种质资源奠定基础。

病程相关基因非表达子1(nonexpressor of pathogenesis-related gene 1，NPR1)不仅对植物系统获得抗性和诱导系统抗性起核心调控作用，而且也是基础抗性以及抗病基因决定抗性的重要调控因子。NPR1可以通过与转录因子TGA2的互作来调控病程相关基因（pathogenesis-related genes，PRs）的表达和抗性的产生。本研究针对我国唐菖蒲生产中病害发生严重且抗源材料匮乏的实际问题，为深入了解唐菖蒲内源免疫机制，以开发新的保护策略，克隆唐菖蒲NPR1及其启动子，以及转录因子TGA2，采用生物信息学、qRT-PCR、亚细胞定位、病毒介导的基因沉默（VIGS）和拟南芥遗传互补等技术分析和验证候选基因的功能。取得的研究成果是：.1.唐菖蒲病毒介导的基因沉默体系的建立.从唐菖蒲中分离PDS基因保守序列，命名为GhPDS (登陆号：KC344859)。利用负压侵染法，获得明显的光漂白表型。沉默植株中GhPDS的转录水平受到显著抑制。.2.病程相关基因非表达1(NPR1)在唐菖蒲抗病过程中的功能分析.1）从唐菖蒲中分离出NPR1以及TGA2基因全长序列。GhNPR1 (登陆号：KJ769203)全长为2243bp，CDS为1767bp，编码588个氨基酸; GhTGA2 (登陆号：KC344858)全长为1925 bp，CDS为1296bp，编码431个氨基酸。推定的唐菖蒲TGA转录因子与拟南芥bzip家族的D亚家族的GroupⅡ同源性最高，与atTGA2同源性最高，达到66.7%。2）实时荧光定量PCR分析表明，GhNPR1在叶片中的表达量大约是小籽球和根中表达量的一半，在花中表达量最低，说明GhNPR1为系统性表达；GhNPR1的表达受水杨酸诱导。 3）烟草亚细胞定位表明GhNPR1定位在细胞核及细胞膜上；而GhTGA2主要定位在细胞核内。双分子荧光互补（BIFC）结果表明GhNPR1和GhTGA2之互作。4）将GhNPR1转到拟南芥npr1突变体中，该基因能够恢复突变体对丁香假单胞菌番茄变种P.s.t DC3000的抗病性。5）沉默唐菖蒲GhNPR1基因，降低沉默植株对车轴草弯孢唐菖蒲变种的抗病性。. 以上研究结果表明，唐菖蒲GhNPR1基因在水杨酸诱导的系统获得性抗病性中具有重要功能。