真菌介导松材线虫Feeding RNAi新技术方法改进及效用评估

RNA interference (RNAi) is a valuable and widely used tool for gene functional study. In the latest study, RNAi could be triggerred by feeding worm fungi of transgenic expression double strand RNA (dsRNA) for the invasive species, Bursaphelenchus xylophilus. This RNAi technology was also known as “Feeding RNAi”, which offered a continuous interference environment for nematode. However, the RNAi efficiency varies between different experiments. So it is necessary to optimize the operating procedures of Feeding RNAi in order to maintain the relative high RNAi efficiency. Meantime, nontarget effect of RNAi has been widely concerned by the researchers since it was developmented. In this study, we planned to analyze the non-target effect by using a nonendogenous target (green fluorescent protein gene, gfp) and an endogenous target (Bx-dpy-4l) under the optimized Feeding RNAi standards. According to the results, we could explore the practical application value of gfp in RNAi control experiment and also the regulation network of Bx-dpy-4l gene after RNAi. Through such analysis, utility of Feeding RNAi could be evaluated to increase its applicability and the possibility in gene functional analysis of pinewood nematode with convenience and efficiency.

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种广泛应用于基因功能分析的研究技术。在最新的研究中，入侵生物松材线虫可经取食表达其靶基因dsRNA的丝状真菌引发，即Feeding RNAi。该技术可为线虫提供持续的干扰环境，但其作用效率在不同实验时存在较大差异，因而通过技术探索优化并稳定Feeding RNAi技术十分有必要。同时，RNAi的非靶效应长期以来便被研究者所广泛关注。本研究计划在优化后的方案中，针对非内源性靶标（绿色荧光蛋白基因，gfp）以及内源性靶标（松材线虫Bx-dpy-4l基因）进行feeding RNAi的非靶效应分析，探索gfp在RNAi对照实验中的实际价值以及靶标基因Bx-dpy-4l干扰后所引起的基因调控表达网路。通过此类分析，可以对Feeding RNAi的效用进行评估，以增加其在基因功能性分析中的应用性，并成为松材线虫研究中一项便捷、高效的技术。

松材线虫是一种极具破坏力的外来入侵物种，对我国以及世界范围内的松树带来严重危害。本研究通过真菌介导的Feeding RNAi来调控松材线虫靶标基因的转录表达，探讨该技术的稳定性和可靠性。本研究以脯氨酰4-羟化酶（P4Hs）为研究对象，发现通过Feeding RNAi可以显著性的降低各个基因的表达，同时线虫Bx-dpy-18和Bx-pdi-2基因干扰后的表型主要是“small”；Bx-phy-2干扰后主要为weak dumpy型。通过干扰后的恢复实验表明Feeding RNAi产生的干扰效应还具有可遗传性，即RNAi效应还可以继续影响后代的基因表达。本研究还继续以AP蛋白相应的基因为研究对象进行了双干扰的研究，结果表明，两个外源dsRNA基因片段可以同时在真菌内稳定表达并影响线虫的基因功能，但双基因同时干扰对线虫的影响较为复杂，虽然会造成靶基因的降低，但同时也会造成与之相关基因的异常表达。此外，我们以ONT三代测序平台进行全长转录组测序分析了GFP-dsRNA基因为非靶对照与正常野生型真菌恒温培养松材线虫转录组情况。结果表明，在实验组中，线虫共有75个表达上调的基因和80个表达下调的基因。这些基因主要参与了NAD+依赖的睾酮脱氢酶、NAD依赖的乙醇脱氢酶、视黄醇脱氢酶、纤维素代谢等有关的生物学过程，进一步我们以Bx-dpy4基因为靶标对象，进行了Feeding RNAi效果的验证，结果发现与野生型对照相比，有 22 个基因显著上调表达，同时却有 93 个基因显著下调表达。综合研究表明，通过外源摄取的 dsRNA 一旦进入细胞内，除了对靶标基因显著影响外，还可能对细胞内其他基因的表达调控起到干扰作用，即使这种外源片段可能与其没有同源性。总之，Feeding RNAi技术给科学分析松材线虫的基因功能带来重要贡献的同时，其本身还存在一定的技术缺陷，值得再未来进行更深入的探讨。