利用真菌介导RNAi解析松材线虫休眠核信号转导机制

Based on the gain of dormancy related Nuclear signal transduction genes daf-3, daf-8，daf-9, daf-12 and daf-16 in the pine wood nematode（Bursaphelenehus. Xylophilus）, We would analyse the mRNA expression patterns of those genes in different stages and ecological environments through the Q-RT-PCR method. The dsRNA of daf-3, daf-8, daf-9, daf-12 and daf-16 would be expessed by Botyfis cinerea . The Botyfis cinerea expressing the dsRNA of target gene would be used to culture the pine wood nematode. when the expression of target gene declined Steady, the nematode would be used for the Phenotypic analysis of development related. The regulation to dormancy role of daf-3、daf-8、daf-9、daf-12、daf-16 will be clear. Our goal is to clarify the molecular basis of the Dormant nuclear signal transduction mechanisns in the pine wood nematode.

本项目拟在获得松材线虫休眠核信号转导相关基因daf-3、daf-8、daf-9、daf-12、daf-16基础上，以Q-PCR方法分析在逆境条件下以及在松材线虫不同发育时期这些基因的表达动态。通过灰葡萄孢菌介导表达松材线虫daf-3、daf-8、daf-9、daf-12、daf-16基因的dsRNA，分别将表达这些基因dsRNA的灰葡萄孢菌喂饲松材线虫，当靶标基因稳定下调后，观察松材线虫表现出来的发育相关表型变化，阐明松材线虫daf-3、daf-8、daf-9、daf-12、daf-16基因在松材线虫休眠调控中的作用，以期解析松材线虫休眠核心号转导机制。

松材线虫作为重要的外来入侵物种已对我国松林造成了严重的破坏，松材线虫基因组测序工作已于2011年完成。本项目以其基因组中两型转化的重要核信号转导基因及其下游调控基因为研究目标，分析了休眠核信号转导基因daf-3、daf-8、daf-9、daf-12、daf-16在逆境下及不同发育阶段下的表达动态；分析了在daf-3、daf-8、daf-9、daf-12、daf-16基因表达量下调10倍后，松材线虫所表现出的休眠特征；分析了在dumpy2、dumpy4、dumpy10、dumpy11基因表达量下调后表现出休眠的特征。在松材线虫两型转化过程中daf-12基因发挥着开关型作用，其功能受阻后松材线虫开启休眠模式，daf-3、daf-8、daf-16-1、daf16-2基因通过调节daf-12/NHR的配体daf-9基因的表达调控daf-12/NHR活性；在daf-3、daf-8、daf-9、daf-12、daf-16-2表达量下降10倍后，松材线虫发育缓慢；daf-8、daf-9、daf-12表达量下降10倍后松材线虫线虫繁殖总量显著减少；daf-3、daf-8、daf-9、daf-12、daf16-1、daf-16-2 表达量下降10倍后松材线虫脂肪含量均显著增加。在以尖孢镰刀菌作为松材线虫的食物时，松材线虫可以生存并且繁殖，但其生长和繁殖速度要比在灰葡萄孢菌中的生长速度慢，借助尖孢镰刀菌作为松材线虫喂饲法RNAi的食物，在表型观察和分析方面更具有优势，其RNAi作用时间在20天后，松材线虫daf-12基因调控的下游基因dumpy2、dumpy4、dumpy10、dumpy11基因表达量下调后表现出休眠的特征，生长受阻体型较小。