内质网磷脂代谢紊乱在成年鸡OPIDN发生中的作用

Previous studies showed that the inhibition of neuropathy target esterase (NTE), which can degrade the substance phospholipid, is an initial step of the organophosphate-induced delayed neuropathy (OPIDN). But the downstream biochemical cascade of the NTE inhibition, which leads to the neuronal axon damage were still unknown. This proposal is to investigate the detailed mechanism of OPIDN by studying the role of endoplasmic reticulum (ER) phospholipid metabolism disorder. The effect of TOCP on changes of ER phospholipid metabolism patterns in adult hen and the in vitro myelination model and/or neuron model generated from the coculture of the Schwann cells and motoneurons isolated from chick embryo, are studied. Correlation of endoplasmic reticulum stress (ERS) and vesicle transport deficiency induced by phospholipid metabolism disorder with OPIDN are further investigated. In addition, a pharmacological method (using inducers and blockers of phospholipid synthesis and degradation) is used to confirm the hypothesis. The results of this study will reveal how OP-modified NTE lead to development of OPIDN, which could help us to further understand the mechanism of OPIDN.

以往的研究显示，在有机磷（OP）引起的迟发性神经毒性（OPIDN）发生过程中，神经病靶酯酶（NTE）（具磷脂酶活性，底物为卵磷脂）的活性抑制是OPIDN的起始步骤，但NTE活性被抑制后其下游生化过程改变及如何引起神经病理损伤的机制却一直未得到阐明。本申请项目研究接触神经毒性OP后神经细胞内质网（ER）磷脂代谢图谱的变化，以揭示ER磷脂代谢紊乱与OPIDN的关系。应用敏感动物成年鸡为动物模型及体外培养鸡神经髓鞘模型为细胞模型。同时检测ER应激状态与囊泡运输功能，了解ER磷脂稳态改变导致ER应激与囊泡运输功能障碍与神经病理损伤的关联。并通过NTE的敲减或过表达研究NTE与磷脂代谢及ER功能的关系。进一步通过生化药理学方法（增加或减少某种磷脂成份的量）验证ER磷脂代谢紊乱在OPIDN发生中的作用。从而确定NTE被神经毒性OP抑制后如何引起OPIDN的发生，进一步揭示OPIDN发生的详细分子机理。

本研究项目以成年鸡为实验动物，以经典的能引起OPIDN的有机磷化合物三邻甲苯基磷酸酯（TOCP）作为诱导剂，以蛋白酶抑制剂（可抑制NTE活性但不能使其老化）苯甲基磺酰氟（PMSF）、内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）作为测试药物，此外，以神经元细胞系SK-N-SH和雪旺氏细胞系sNF96.2作为细胞模型，研究NTE与内质网应激在OPIDN中的作用，探索OPIDN的发生机理。通过上述整体动物实验和细胞生物学实验结合磷脂组学分析发现，TOCP处理可以导致磷脂代谢的重要的中间代谢产物二酰甘油（DAG）和磷脂酸（PA）的含量降低，但PMSF处理可以阻止这种降低。此外， TOCP处理后，59种差异磷脂中有30种磷脂含量明显升高，29种磷脂水平显著降低， PMSF预处理可恢复或部分恢复发生显著变化的磷脂组分至接近对照水平。通过细胞内质网磷脂组学分析发现，磷脂水平在NTE低表达和高表达的神经元细胞有很大差异，其中一类磷脂是在NTE低表达的细胞中含量升高（主要是NTE的底物及其底物参与合成的磷脂）；另一类磷脂是在NTE高表达的细胞中含量降低（主要是NTE的底物被催化后生成的产物参与合成的磷脂），强烈提示NTE在磷脂代谢中的作用。此外，动物实验表明，给予4-PBA可有效减缓TOCP引起的OPIDN的症状和神经组织损伤。无论是体内实验还是体外实验，无论是在神经元细胞还是雪旺氏细胞，结果都表明4-PBA能减轻由TOCP引起的内质网应激蛋白GRP78和CHOP的升高，减缓内质网应激的发生，但对TOCP抑制NTE活性的作用没有明显影响，说明内质网应激抑制对OPIDN的缓解作用并非通过阻止TOCP对NTE活性的抑制发挥作用，很可能是通过降低内质网应激蛋白水平实现对OPIDN的缓解。..上述研究不仅进一步确定NTE在OPDIN发生中的作用，同时揭示除了NTE以外还有其他的调控路径参与OPIDN的发生或/和发展，而且为以NTE活性改变或内质网应激抑制等为代表的药物干预或减缓OPIDN发生发展的实际应用提供了重要的科学基础。