雄激素非依赖性前列腺癌细胞核内关键AR结合分子的筛选与功能研究

Prostate cancer is one of the most common male urinary systerm tumors and can be easily transformed into androgen independent prostate cancer (AIPC) after endocrinal treatment, which poses an enormous challenge to the later treatment, yet, its real transformation mechanism can not been elucidated.From our former study, the twos trains of AIPC cell lines induced by our research group have a declining dependence on androgen but androgen receptor is still needed, which revealed the different function of AR in the nucleus. ADPC and AIPC cell lines will be taken as our research objects, the key AR combined proteins of nucleus will be selected by Co-immunoprecipitation and Mass spectrometry technologies,then authenticated by Immunohistochemistry and Western-Blot. In addition, the key AR target genes of nucleus will be screened by Chromatin Immunoprecipitation sequence and Bioinformatics analysis, then, authenticated by FISH and Polymerase Chain Reaction. Those key AR binding molecules will be comfirmed in clinical specimens by Realtime-PCR and Immunohistochemistry. The functions of those key AR binding molecules will be researched by gene interference and transfection in the cellular level.Our reseach is expected to screen AR co-regulators and target genes, thus can give us new ways to the reseach of drug-resistance of AIPC for further study.

前列腺癌是男性泌尿系最常见肿瘤之一，经治疗后易转化为雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)，给后期治疗带来极大困难，但其真正的转化机制尚未阐明。本课题组前期研究发现不同条件诱导的AIPC细胞株对雄激素非依赖性存在显著差异但细胞生长均依赖雄激素受体，强烈揭示AR在细胞核内作用存在差异性；本课题拟采用雄激素依赖性前列腺癌LNCaP和AIPC细胞株为研究对象，采用免疫共沉淀-质谱联合技术筛选核内关键AR结合蛋白，用免疫组化和WB进行鉴定；染色质免疫共沉淀测序技术和生物信息学分析筛选关键AR靶基因，用FISH和PCR技术进行鉴定；进一步用组织标本进行临床证实；采用基因干扰和转染技术从细胞水平研究关键AR结合分子的功能。本课题有望筛选出AIPC细胞核内关键的AR结合分子，为下一步研究雄激素非依赖性前列腺癌耐药机制提供新的研究思路。

前列腺癌由雄激素依赖性向雄激素非依赖性的转变是前列腺癌致命的进展，不同条件诱导的 AIPC 细胞株对雄激素非依赖性存在显著差异但细胞生长均依赖雄激素受体，强烈揭示 AR 在细胞核内作用存在差异性。在对雄激素非依赖性前列腺癌细胞核内关键AR结合分子的筛选和功能研究过程中，我们发现了AR多个关键结合分子。具体为：（1）采用染色质共沉淀技术发现雄激素非依赖性和依赖性前列腺癌细胞中AR的差异表达基因425个，对Peak相关基因进行通路分析，发现黏着斑、代谢、癌症中的转录错误调控、嘌呤代谢等信号通路相关的基因占绝大多数；（2）采用免疫共沉淀-质谱联合技术筛选核内关键 AR结合蛋白27个，其中AR共激活因子22个，AR共抑制因子5个。主要为热休克蛋白类、细胞骨架类蛋白、泛素化蛋白、RNA聚合酶II及与该酶结合蛋白类、基本转录因子类等； (3) 随后我们利用shAR慢病毒干扰LNCaP-AI细胞雄激素受体的表达，对其中筛选出来的靶基因与雄激素受体的调节关系进行了研究，发现雄激素受体负向调节LNCaP-AI细胞FN1和ZNF438基因的表达；(4) 免疫共沉淀结合SDS-PAGE分离-考马斯亮蓝染色-质谱鉴定胶条共筛选到8个高丰度的蛋白，它们是：MYH9、HSP90B1、HSP70、LYAR、ACTB、APEX1、磷酸丙糖异构酶和HMGB1；（5）利用染色质免疫共沉淀测序技术联合生物信息学分析发现SGK1是AR的一个关键下游靶基因，进一步研究发现抑制SGK1可激活自噬介导的caspase依赖的内源性细胞凋亡途径；(5)利用免疫共沉淀、免疫印迹、QRT-PCR、shRNA干扰、及荧光共定位等技术验证MYH9，MYH9为AR的共抑制因子。本课题研究所发现的核内关键AR结合蛋白或基因为前列腺癌的雄激素非依赖性转变机制提供重要的实验依据。