树突状细胞介导的Notch1通路对IBD条件下肠黏膜Treg淋巴细胞免疫失衡的调控作用及机制研究

Immune imbalance of intestinal mucosa is one important factor leading to inflammatory bowel disease. Recent study found that CD4+Foxp3+T regular lymphocytes are not simply a "protector" in IBD. It could differentiate into IL17+Foxp3+T lymphocytes and the "protector" will change into a "destroyer". However, the mechanism is not clear. Our pilot study found that recombinant DLL1 can induce differentiation of CD4+Foxp3+Treg into IL17+Foxp3+T lymphocyte through Notch1 signaling pathway. Previous researches have shown that CD11+dendritic cells mediated Notch1 signaling plays important role in the differentiation of T lymphocytes through regulating the expression of Foxp3 and ROR γ t. So,we hypothesize that Notch1 signaling may also play important role in the differentiation and function of IL17 +Foxp3+T lymphocyte. This study aims to investigate the role of Notch1 signaling in the differentiation and function of CD4+Foxp3+Treg and IL17+Foxp3+T lymphocytes. The research will be carried out in IBD animal model and in vitro T cell culture model with the method of immune magnetic bead sorting, flow cell biology technology, et al. This study will provide new strategy for the research of mucosal immune imbalance and intestinal barrier protection of IBD.

肠黏膜免疫功能失衡是炎症性肠病IBD发生、发展的重要因素。研究显示：IBD条件下，CD4+Foxp3+Treg并不是单纯的“保护者角色”，其可分化为IL17+Foxp3+T细胞，由“保护者”演变为“破坏者”，但机制不清。我们前期研究发现，重组DLL1可促进CD4+Foxp3+Treg分化为IL17+Foxp3+T细胞；由于树突状细胞DCs介导的Notch1通路可调节转录因子Foxp3和RORγt表达而调控CD4+T淋巴细胞双向分化，我们推测：Notch1通路很可能在IL17+Foxp3+T细胞的分化和功能中发挥重要调控作用。本研究拟利用IBD动物模型及体外T细胞培养模型，结合免疫磁珠分选、流式细胞等技术，研究Notch1通路在CD4+Foxp3+Treg分化为IL17+Foxp3+T细胞以及二者在肠黏膜免疫功能调控中的作用和机制，为IBD肠黏膜免疫失衡及肠黏膜屏障损伤研究提出新靶点和策略。

肠黏膜的免疫功能失调可破坏肠黏膜稳态，是导致炎症性肠病的重要原因。巨噬免疫细胞是肠黏膜免疫系统中的重要一员，是抵御细菌入侵和肠黏膜损伤的“哨兵”，是维护肠黏膜稳态的重要成员。Notch信号通路在肠黏膜稳态的维持中发挥着非常重要的作用，而且既往研究明确，Notch信号通路在巨噬细胞的生长发育和功能调控中发挥重要作用，Notch信号通路功能异常则导致巨噬细胞的活性和功能异常。我们的研究发现，Notch信号通路与脂多糖LPS引起的巨噬细胞的凋亡密切相关。给予体外培养的RAW 264.7细胞脂多糖LPS干预一定时间后，Real-time PCR检测发现巨噬细胞内Jagged1、Hes1、 Hes 5和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF的mRNA表达明显升高；western blot和ELISA检测发现Notch1的活性片段NICD1及GM-CSF蛋白表达明显升高，而且升高的程度与LPS干预的浓度和干预的时间密切相关。上述结果表明，LPS刺激巨噬细胞可激活Notch信号通路，而且与此同时巨噬细胞表达GM-CSF明显升高。给予RAW 264.7细胞γ分泌酶阻断剂DAPT或SiRNA干扰抑制Notch信号通路的激活，western blot检测JNK以及NF-B的磷酸化水平，结果提示JNK以及NF-B的磷酸化被明显抑制；重要的是，Notch1信号通路被阻断同时，GM-CSF的表达明显降低。然后，给予RAW264.7细胞JNK阻断剂SP600125，阻断JNK的磷酸化，结果提示NF-B的磷酸化被明显抑制，同时GM-CSF表达明显降低。上述研究提示，Notch通路激活后通过JNK-NF-kB通路促进了GM-CSF的表达。流式细胞学技术检测LPS刺激后RAW264.7细胞的凋亡水平变化，给予细胞DAPT或SiRNA抑制Notch1表达，给予LPS刺激后流式细胞学技术检测细胞凋亡水平的变化，结果发现LPS明显促进了细胞的凋亡，而阻断Notch1表达后细胞的凋亡水平明显升高，这提示Notch1信号通路激活后具有抑制LPS导致的巨噬细胞凋亡的作用。上述研究结果表明，LPS刺激巨噬细胞可激活Notch1信号通路，通过JNK/ NF-kB促进GM-CSF的表达，抑制LPS导致的巨噬细胞的凋亡。上述结果，为肠黏膜稳态研究提供了新的靶点和策略，为炎症性肠病的预防和治疗提供了新思路。